L-谷氨酸对苹果果实抗氧化能力的影响

杨佳丽，荆志怀，张星，王如福

山西农业大学食品科学与工程学院（晋中 030801）

苹果（Malus domesicaBorkh.）营养丰富，兼具食用、药用价值，产销需求旺盛，是我国传统的大宗水果之一[1]。苹果属呼吸跃变型果实，在采后贮运期间易被病原菌侵染，尤其是由扩展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病会造成果实发生大范围的腐烂[2]。目前，化学杀菌剂依然是控制采后真菌病害最行之有效的方法，但其频繁使用会对环境和食品安全产生较大的危害。利用诱导因子激活果实内在的抗性机制已成为当前果蔬采后病害防治中的研究热点[3]。

L-谷氨酸是植物体内一种非常重要的氨基酸，不仅参与多种氨基酸的合成，且调节着一些重要的生理代谢过程，尤其是以其为前体物质的代谢产物（如γ-氨基丁酸、精氨酸、脯氨酸），与植物的抗逆境胁迫密切相关[4]。已有研究显示，L-谷氨酸在植物响应外界非生物胁迫时可能发挥重要作用[5]。然而目前有关L-谷氨酸在植物与病原菌互作中的作用还鲜有报道。近年来，有研究提出L-谷氨酸代谢参与了植物的防御反应，同时其参与方式可能与病原菌的种类有关[6]。前期的研究中也首次明确了L-谷氨酸可作为一种理想的化学诱导因子激发番茄果实对黑斑病产生抗性，且其抗性机制可能与碳氮代谢有关[7]。为进一步揭示L-谷氨酸的诱抗机制、扩大其适用范围，以苹果果实为研究对象，探讨L-谷氨酸对果实青霉病的抑制效果以及作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用的红富士苹果（Malus domesicaBorkh. cv.Fuji）产地为山西运城，购于山西晋中当地的水果批发市场。挑选大小均匀、无机械损伤、成熟度一致的果实进行试验；Penicillium expansum为实验室保藏菌种。

L-谷氨酸，分析纯，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，使用前将其pH调至7左右，并用0.45 μ m滤膜处理。

1.2 试验方法

1.2.1 孢子悬浮液的制备

Penicillium expansum在PDA培养基中28 ℃条件下培养7 d，利用无菌水将病原菌孢子洗出，随即利用血球计数板将孢子悬浮液调整至所需浓度，备用。

1.2.2 原料处理及取样

前期研究显示0.1 g·L-1L-谷氨酸可有效抑制青霉病病害的发生，此次试验选用此浓度开展后续研究。在果实表面赤道位置用灭菌打孔器制造2个大小深度一致的孔（直径约5 mm，深度约2 mm），分别注入30 μ L的无菌水和0.1 g·L-1L-谷氨酸溶液。在恒温、恒湿条件下（25 ℃，相对湿度约95%）诱导处理24 h，然后向每个孔接入20 μL的青霉菌孢子悬浮液（104spores·mL-1），并用保鲜膜密封置于恒温恒湿箱中。贮藏期间每天定时观察果实的发病情况，同时取病斑周围的果肉组织，立即用液氮冻存，置于-80℃下备用。每个处理重复3次，每个重复至少9个果实，整个试验重复2次。

1.3 项目测定

1.3.1 发病率和病斑直径的测定

发病率按式（1）计算。病斑直径用十字交叉法取平均值。

发病率=发病果实/总果实数×100% （1）

1.3.2 抗氧化酶活性和丙二醛含量的测定

过氧化物酶（Peroxldase，POD）活性测定参照Lurie等[8]的愈创木酚法；过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定依据Aebi等[9]的方法；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）利用南京建成生物工程研究所试剂盒测定；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量参照余辰[10]的方法测定。

1.3.3L-脯氨酸和草酸含量的测定

L-脯氨酸和草酸含量利用气相色谱质谱联用技术（GC-MS技术）分析测定。样品的提取和衍生化处理参照Pedreschi等[11]的方法进行。

GC-MS反应条件：采用TR-5色谱柱（30 m×0.25 mm内径，0.25 μm膜厚）；载气，氦气（流速1.0 mL·min-1）；升温程序，柱温70 ℃保留2 min，以10 ℃·min-1升高至220 ℃，最后以20 ℃·min-1上升到260 ℃保留3 min；分流进样，进样量1 μL，流速5 mL·min-1，分流比5∶1；电离方式，电子轰击离子源（EI），电子能量70 eV；传输线温度，240 ℃；全谱扫描质量范围，m/z50～650。

1.4 数据分析

试验数据利用SPSS/PC ver. II.x软件进行Duncan’s差异分析，p＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 外源L-谷氨酸对苹果青霉病的影响

如图1所示，随着接种时间的延长，果实的发病率和病斑直径逐渐上升。在图1（A）中，苹果在接种3 d 后，对照组发病率达到48.1%，而L-谷氨酸处理组仅为27.8%；在接种第4天时，相对于对照组，处理组发病率下降了27.8%。与发病率类似，L-谷氨酸处理组的病斑直径也显著低于对照组（图1B），尤其是在第3天时，处理组降低了约44.9%。可见L-谷氨酸对苹果青霉病有较好的抑制效果。

图1 L-谷氨酸对苹果青霉病的影响

2.2 外源L-谷氨酸对丙二醛含量的影响

当植物体内的活性氧大量积累时会诱发膜脂过氧化产物MDA的增加。如图2所示，果实自被侵染24 h后，MDA含量呈逐步上升趋势，且处理组在侵染过程中低于对照组，尤其是在72 h时，对照组为处理组的1.37倍。

2.3 外源L-谷氨酸对果实抗氧化酶活性的影响

植物在长期进化中形成了应对外界环境胁迫时产生的自我防御系统，如抗氧化酶系统。如图3（A）所示，POD活性整体呈先升后降的趋势，在接种病原菌后的前24 h，L-谷氨酸处理组明显高于对照组，具体来说在0 h和24 h时，POD活性分别为对照组的1.46倍和1.21倍。同时图3（B）中的结果显示，经L-谷氨酸处理后的果实在被病原菌侵染前期，CAT活性迅速上升，而后虽趋于平缓，但在整个侵染过程中依然高于对照组，尤其在24 h达到峰值时，约为对照组的2.11倍。SOD活性在处理期间的变化趋势与上述POD和CAT类似，可被L-谷氨酸快速诱导提高（图3C）。

图2 L-谷氨酸对MDA含量的影响

图3 L-谷氨酸对抗氧化酶活性的影响

2.4 外源L-谷氨酸对L-脯氨酸和草酸含量的影响

已有文献报道，L-脯氨酸和草酸可作为有效的抗氧化剂，可清除活性氧。GC-MS分析结果显示，在病原菌侵染早期（24 h），苹果经外源L-谷氨酸处理，其体内的脯氨酸含量与对照组并无差异，随着病害的进一步发展，达到72 h时，L-谷氨酸约为对照组的1.43倍（图4A）。试验还发现，L-谷氨酸对果实中草酸的含量也会产生一定的影响，如图4（B）所示，相比于对照组，L-谷氨酸处理组中的草酸含量显著增加，尤其是在72 h时，草酸含量提高了26.9%。

图4 L-谷氨酸对L-脯氨酸和草酸的影响

3 讨论与结论

在前期研究中已初步证实L-谷氨酸可作为一种激发因子，有效抑制由Alternaria alternata引起的番茄黑斑病[7]。在此次试验中，苹果果实经0.1 g·L-1L-谷氨酸诱导处理，可以显著降低青霉病的发病率和病斑直径，抵御病原菌P.expansum的侵染，这与L-谷氨酸对A.alternata的作用规律一致。P.expansum是典型的腐生型病原菌，其营养获取主要是来自死亡的宿主细胞或组织。当植物被病原菌侵染时，其体内会产生大量的活性氧，从而诱发膜脂过氧化和膜透性丧失，最终导致宿主细胞受到伤害甚至死亡，也就是说活性氧在果实体内的大量积累非常利于腐生型病原菌的侵染[11]。然而植物在长期的进化中形成了一套完善有效的活性氧清除系统保护机体免受伤害，如抗氧化酶系统。在该系统中，SOD可催化超氧阴离子自由基，歧化生成O2和H2O2，POD和CAT等抗氧化酶可将活性氧H2O2分解为O2和H2O，从而抑制过量活性氧的积累，减弱膜脂过氧化造成的细胞膜系统损伤，其中MDA可作为衡量膜脂过氧化程度的一个重要指标[12]。此次试验发现，苹果在被P.expansum侵染时，L-谷氨酸会迅速诱导果实抗氧化酶POD，CAT和SOD活性的提高，并能有效抑制MDA的积累。这与Yang等[13]的研究结果类似，番茄果实经外源GABA处理后增强对A.alternata的抗性，可能与提高抗氧化酶活性有关。也就是说，L-谷氨酸可能是通过激活果实体内的抗氧化酶系统，阻止过量活性氧产生和膜脂过氧化。

近年来的研究表明，植物体内积累的活性氧还可以通过抗氧化剂来清除，如脯氨酸和草酸[14]。草酸是广泛存在于动植物体内的一种代谢产物，可通过与金属离子螯合剂发生Fenton反应来影响机体内的活性氧代谢[15]。目前，草酸已作为天然的抗氧化剂，被广泛应用于果蔬保鲜领域。有研究发现，桃果实在被草酸处理后，果肉中的H2O2和超氧化物自由基含量会明显降低[16]。脯氨酸作为蛋白氨基酸之一，可在吡咯琳-5-羧酸合成酶（P5CS）和吡咯琳-5-羧酸还原酶（P5CR）的催化下由L-谷氨酸作为底物直接合成。脯氨酸在参与响应植物逆境胁迫中占据重要地位，尤其是在抗渗透胁迫中，可作为一种惰性的相容性渗透物质，来调节细胞质和液泡间的渗透压平衡[17]。同时，有研究报道脯氨酸还可以作为一种有效的抗氧化剂清除活性氧，通过与抗氧化酶系统协同作用调控机体内活性氧的平衡[18]。此次试验发现，苹果在遭受病原菌的侵染时，L-谷氨酸处理会提高果实体内抗氧化剂草酸和脯氨酸的含量，这可能会抑制活性氧的大量生成，从而给予果实对P.expansum产生更强的抗性。

L-谷氨酸作为化学诱导因子，因其生产贮藏成本低，容易获得且安全环保，在果蔬采后病害领域内具有广阔的商业应用前景。通过研究L-谷氨酸对苹果抗氧化能力的影响发现，其对腐生型病原菌P.expansum的抗性机制可能与抗氧化酶系统的激活和某些抗氧化剂（如L-脯氨酸和草酸）的积累有关，从而阻止活性氧对宿主细胞的伤害，这将为L-谷氨酸作为新型化学诱导剂的商业化提供一定的理论依据。