冻融对高效液相色谱-质谱联用法检测鸡蛋中氟苯尼考稳定性的影响

王 磊 王鲁霞 刘延平 朱 辉 陶相锦

菏泽市食品药品检验检测研究院 山东菏泽 274000

鸡蛋作为一种廉价优质的蛋白质来源，保障了我国居民饮食结构中蛋白质的基本需求。2017年我国鸡蛋产量已达到2 609.5万t，位居世界首位[1]。目前我国允许使用于产蛋期蛋鸡中的抗生素种类比较少，由于氯霉素药物对人体健康有严重的毒副作用，能抑制骨髓造血机能，引起人的再生障碍性贫血等疾病[2]，已禁止在食用源性动物产品上使用。而氟苯尼考作为氯霉素的衍生物，是一种新型的酰胺醇类广谱抗生素，它具有抗菌谱广、安全高效等特点，氟苯尼考已替代氯霉素药物的应用[3]。有研究报道表明，氟苯尼考可用于鸡治疗敏感细菌所致的细菌性感染，尤其对于鸡金黄色葡萄球菌感染治疗效果明显[4]。氟苯尼考相对于氯霉素和甲砜霉素毒性较低，但对哺乳动物具有胚胎毒性，长期食用含有氟苯尼考及其代谢物的动物源食品将会对人体产生严重的安全隐患[5]。我国农业部第235号公告规定，氟苯尼考在鸡肉中的最高残留限量(MRL)不得超过100μg/kg，在家禽的肝脏、肾脏中的最高残留限量分别不得超过2 500、750μg/kg，而在蛋制品中不得检出。因为氟苯尼考会轻度抑制生殖激素的产生，造成鸡蛋早期胚胎的死亡，因此蛋鸡产蛋期禁用。滥用氟苯尼考会引起动物性食品兽药残留，进而可能对人类健康产生危害，以及致病菌株耐药性的产生。目前，检测动物组织中氟苯尼考残留的方法主要包括气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)[6～10]等。而液相色谱-串联质谱法定性定量准确，灵敏度高，不需要衍生化，抗干扰能力强，故为理想的氟苯尼考残留量分析方法[11]。有研究考察了反复冻融对畜禽肉品质的影响，发现冻融次数增加,胆固醇含量逐渐降低，胆固醇氧化物的含量先逐渐增加，后趋于平稳[12]。探究冻融循环对水产品肌肉蛋白pH值影响，其呈现先上升后下降的趋势，与肌肉品质密切相关[13]。而冻融处理对于氟苯尼考含量的影响未有研究。

本试验研究了冻融处理对检测鸡蛋中氟苯尼考含量的影响，液相色谱-串联质谱法的准确度和精密度能满足药物残留检测限量的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氟苯尼考标准溶液，农业部农产品质量标准研究中心提供，批号：8003，浓度100μg/mL。用甲醇溶解配制成浓度为1.0μg/mL的标准中间储备液，临用时准确量取适量标准储备，液用流动相稀释成适宜浓度的标准工作液。

化学试剂：乙腈，甲醇，色谱纯；甲酸，分析纯；所有试剂均用超纯水配制。

1.2 仪器与设备

主要仪器：高效液相色谱-质谱联用仪TQ-MS，Waters公司；

电子分析天平ME204，METTLER TOLEDO公司；

高速冷冻离心机3K15，德国SIGMA公司；

数控超声波清洗器KQ-500DB型，昆山市超声仪器有限公司；

固相萃取装置，Waters公司；

氮气吹干仪OA-HEAT型，Organomation公司；

多管漩涡混合仪HD-2500型，杭州佑宁仪器有限公司；

具塞塑料离心管；

有机相针式滤器(0.25μm)；

HLB固相萃取柱Oasis Prime HLB 6 cc/200 mg，Waters公司；

200μL、1mL移液枪，Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱操作条件及质谱条件

色谱柱参数：Acquity UPLC BEN C18(2.1mm×100mm，粒径1.7μm)。

流动相：0.1%甲酸/水溶液为A相，乙腈为B相，流动相初始比例为水∶乙腈=50∶50(V/V)。线性梯度洗脱(0～1min，50%B→50%B；1～1.5min，50%B→90%B；1.5～2min，90%B→90%B；2～2.1min，90%B→50%B；2.1～5min，50%B→50%B)。

流速：0.3mL/min。

柱温：40℃。

进样体积：5μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)。

扫描方式：负离子扫描。

监测方式：多反应监测(MRM)。

毛细管电压：3 000V。

离子源温度：350℃。

1.3.2 标准工作液的制备及标准曲线制作

精确量取氟苯尼考标准中间储备液1mL，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀即得100ng/mL标准储备液；然后用0.1%甲酸/乙腈/水溶液(90+10)依次稀释成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL的标准工作液。

标准曲线制作(如图1)：按浓度由小至大的顺序，用微量注射器依次注入5μL的0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/mL标准工作液，按色谱操作条件，用HPLC-MS/MS检测，得到色谱图，峰面积及保留时间，并计算其线性关系和相关系数。计算可得，氟苯尼考在线性范围内有良好的线性关系，标准曲线的相关系数R2为0.9949，符合要求范围。

图1 氟苯尼考标准曲线图Fig. 1 Fluorfenicol standard curve

1.3.3 样品的提取净化步骤

(1)提取。

将取自同一检验批次的10枚鸡蛋样品制成匀浆。准确称取2.00g样品匀浆，置于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL 80%乙腈和20%水混合液，涡旋振摇2min，超声波提取15min，再涡旋提取2min后，以8 000r/min离心15min，吸取上清液待净化。

(2)净化。

用HLB固相萃取柱进行净化。HLB固相萃取柱为亲水亲脂平衡的水可浸润性的反相吸附剂，不影响吸附剂床的干涸，无须活化，直接上样，可对氯霉素类药物进行选择吸附，有效去除样品中的基质干扰物，对蛋样基质能达到较好的净化效果。取上述提取的上清液过柱，控制流速不超过1.0mL/min。洗脱液于45℃用氮气吹干，浓缩物用1mL 0.1%甲酸/乙腈/水溶液(90+10)溶解，涡旋混合1min，超声波混合15min，再涡旋混合1min，0.25μm微孔滤膜过滤，滤液用于HPLC-MS/MS检测。取滤液5μL注入色谱柱，记录氟苯尼考的峰面积。

1.3.4 样品回收率测定

样品回收率测定。称取5份鸡蛋样品匀浆，每份2.00g，置于50mL聚丙烯离心管中，分别加20、40、60、100μL的100ng/mL标准工作液，经上述方法提取和净化，进行HPLC-MS/MS检测，求得氟苯尼考在2、4、6、10ng/g水平上的鸡蛋样品回收率。

1.3.5 起泡性测定

用量筒量取100mL蛋液样品倒入500mL烧杯中，每个温度下制备3个平行组，并在测量前进行冻融循环处理。静置后置于-18、4、25℃环境条件下，12h后取出，在室温条件下解冻放置12h，此为1次冻融循环。将打蛋机搅拌棒置于烧杯中，均匀打发90s，测量泡沫和液体的体积。起泡性的计算如公式(1)：

(1)

1.3.6 析水率测定

将所制备的鸡蛋液，搅拌均匀，取5g倒入离心管中，将冻融处理后离心管中的样品在8 000r/min条件下离心15min，弃去上清液，称取沉淀物质量，计算析水率，利用析水率表征蛋液冻融稳定性，根据公式(2)计算析水率：

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

利用UPLC节省了分析时间，但UPLC载样量小，要求使用三重四极杆质谱扫描时能够达到最佳的灵敏度，由于食品基质复杂，故选择载样量和分离度适当，粒径为1.7μm的色谱柱。以获得对称尖锐的峰形为目标，分别考察了不同配比的流动相和不同有机相增速的分离效果，考察流动相能否满足物质的分离和峰形要求。计算样品回收率可知，本实验关于氟苯尼考的处理方法计算出的回收率都在标准规定的范围内，操作合乎规范。

对于不同有机相配比流动相对氟苯尼考TIC总离子流图的影响如图2所示。在相同的流速条件下，不同有机相配比的流动相对氟苯尼考的出峰时间影响较大，随着有机相配比的增大，氟苯尼考的出峰时间总体呈现先增大后减小的变化趋势。如表1所示在60%～80%的变化过程中，出峰时间从1.92min增大到2.78min。在80%～90%的变化过程中，出峰时间从2.78min变化到2.24min，当有机相配比为80%时，标样的出峰时间最长，之后则随着有机相配比的增大而减小。出峰时间在前期出现了增加的现象，可能是有机相增多所导致氟苯尼考在色谱柱上的保留增大的缘故。其中，随着有机相比例升高，氟苯尼考的峰形变宽。氟苯尼考的峰形对流动相比例的变化较为敏感，过高或者过低的有机相配比所出峰形更尖锐，而在90%有机相配比的条件下，氟苯尼考的含量最大。在适当的有机相比例条件下，氟苯尼考也会出现对称、尖锐的单峰，见图3所示。

图2 不同配比流动相的影响Fig. 2 Influence of mobile phase with different proportions

表1 不同配比流动相条件下的参数Table 1 Parameters of mobile phase with different proportions

图3 流动相时间梯度的影响Fig. 3 Influence of time gradient of mobile phase

同时对有机相增速进行优化，发现，在随着有机相流速的增大，氟苯尼考的保留时间未受影响，而氟苯尼考的检测含量随着乙腈流速的增大出现先增大而后减小的变化趋势，且在1.5min时，检测含量达到最大(见表 2)，说明过高的有机相流速不利于氟苯尼考在柱子上的保留，使得检测含量偏低，氟苯尼考更适合流速适中的有机相，而不同的增速都能够得到峰形尖锐的总离子流图。

表2 不同流动相时间梯度条件下的参数Table 2 Parameters under different time gradients of mobile phase

2.2 冻融对氟苯尼考含量的影响

冻融温度和周期对蛋液中氟苯尼考含量的影响如图4所示。

图4 冻融温度和周期对氟苯尼考含量的影响Fig. 4 Effects of freeze-thaw temperature and cycle on the content of fluphenicol

对比不同温度条件下氟苯尼考的含量变化，发现未经过冻融处理的蛋液中氟苯尼考的含量较高，这可能是因为低温的存储过程中，存在着蛋白质变性和水分减少2个竞争的过程[14]。经过冻融处理，蛋白质的分子结构被破坏，氟苯尼考分子可能与蛋白质存在分子对接关系，这种相互关系的破坏使得氟苯尼考检测含量的下降。全蛋液经1次冻融循环后，对应氟苯尼考的含量显著下降。有研究发现，冷冻时间超过5h后，蛋清液从水分减少占优变为蛋白质变性占优，蛋清和全蛋粘度下降[15]。全蛋液包括蛋清和蛋黄，而蛋黄在冷冻后低密度脂蛋白的水化层由于冰晶的形成而被破坏，可改变其分子折叠的程度[16]。而之后的冻融处理过程中，氟苯尼考含量的变化不再明显。表明对于全蛋蛋液，冻融处理能在一次处理后显著降低氟苯尼考的检出含量，冻融对氟苯尼考含量的影响较大。但对于不同的处理温度，发现在室温条件下，氟苯尼考存在自然降解的过程。但总体而言，冻融温度的影响要大于冻融周期的影响。

2.3 冻融对蛋液起泡特性的影响

起泡性指蛋白质在一定条件下生成泡沫的能力[17]。冻融处理对鸡蛋蛋液起泡特性的影响变化见图5。

图5 冻融温度和周期对蛋液起泡特性的影响Fig. 5 Effects of freeze-thaw temperature and cycle on foaming characteristics of egg liquid

由图5可知，在整个冻融周期内，-18℃条件下储藏的蛋液起泡性，随着储藏时间的延长变化最显著，起泡性呈递减的趋势，起泡性起始值为133.2%，经过一次冻融处理后，起泡率变为40.9%，之后开始出现逐渐降低的趋势；4℃和25℃储藏的鲜蛋起泡性也呈下降的趋势，但与-18℃条件下的变化相比较而言，变化较为平缓。且25℃和4℃贮藏起泡性随冻融处理周期的增长一直高于-18℃贮藏的蛋清液样品。这是因为，温度升高有利于蛋清起泡性的提高，表面张力会随着温度的升高而下降，更有利于样品形成泡沫[18]。

对鸡蛋液起泡性此前已有大量研究。发现在蛋液搅打的过程中，通过外界的作用力将蛋清蛋白的球型分子构造打破，折叠的蛋白分子打开，使其分子中的羧基、氨基、巯基、肽键等活性基团裸露出来。同时，疏水基团暴露，界面张力降低，并将空气混入蛋液中与疏水基团结合，使泡沫体积迅速上升[19]。在一定温度范围内，温度越高，越有利于泡沫的形成。但常温条件下，蛋白层的组成比例将发生显著变化[20]，微生物繁殖，蛋清液pH值下降，又会对蛋清液的起泡性产生影响[21]。而较低的温度时，由于线形蛋清蛋白分子链取向在水分子冻结的作用下而被破坏，暴露出的活性基团数也会相应的减少，所形成的包裹着空气的致密网络结构变得不再稳定，相应的气泡率降低。

2.4 冻融对蛋液析水率的影响

图6为经过搅打的蛋液在不同冻融循环周期的析水率变化。

图6 冻融温度和周期对蛋液析水率的影响Fig. 6 Effects of freezing and thawing temperature and cycle on water leaching rate of egg liquid

冻融稳定性主要通过反复冻融后测定基体析水率来反映的。析水率越低，表明冻融稳定性越好。由图6可知，蛋液在经过不同贮藏温度的处理后，经1次冻融循环，对应-18℃处理的蛋液析水率明显低于4℃和25℃实验组，-18℃低温贮藏的蛋液样品的析水率迅速下降至45.8%。这主要是因为，-18℃条件下析水率的变化最为显著，在-18℃条件下，水分经历了由液态水分子到冻结态的转变。低温冻结后的蛋白结构与水分子的束缚性变强，这也与其对应起泡性的变化趋势一致。然而，当进行第3次冻融循环后，-18℃处理实验组水分几乎没有析出，而4℃和25℃处理实验组析水率仍然保持在70%左右。多次低温冻融循环后，其冻融稳定性逐渐变差。较低的温度或较多的冻融周期，都会导致析水率的降低，这是由于冻融周期越长，或温度越低，蛋清蛋白分子结构被破坏的程度越大。在25℃温度条件下，冻融周期的不同阶段，析水率保持在67.8 %左右。

全蛋液很容易出现脱水的现象，这可能和其微观结构有关。对于蛋黄/蛋清全蛋体系而言，冷冻后蛋白质变性，鸡蛋的蛋黄和蛋白的结构及胶凝性逐渐发生变化[15]。析水率反映出大分子的持水特性。较低温度的反复冻融会导致析水率的下降，这是由于在较低的温度下，在冻结的水分子作用力条件下，蛋白所形成的完整高分子网络结构破坏，蛋液变为流质状。

3 结论

本文研究了冷冻储存冻融处理对鸡蛋中氟苯尼考检测含量的影响。通过考察不同有机相配比和乙腈的增速的影响分析，确定了90%的乙腈有机相为最适浓度比例。研究表明，有机相的增速对氟苯尼考峰形和响应值的影响并不明显，都能出现比较合适的氟苯尼考单峰。-18℃低温处理会导致氟苯尼考检测含量的显著下降，且随温度的降低影响越明显。冷冻达到一定程度时，鸡蛋中的蛋白质开始变性，蛋白质的二级结构变化，界面张力改变，影响蛋白质的起泡性，且以-18℃的影响最为显著。对于蛋液析水率的变化，冻结温度以上的处理不能影响持水特性的改变，低温导致稳定性变差，持水率降低。冻融温度能显著影响全蛋液的理化性质，冻融周期的处理进一步影响了全蛋液凝胶的冻融稳定性。