牙龈卟啉单胞菌与细胞自噬相互作用研究进展

郭艺博，刘怡文，孙 蔚，张秀森，孙玲云，张顶彧，原 翔，高社干

细菌已经演化出多种入侵真核细胞并在细胞内定植、增殖的机制[1]。当外来病原菌侵入细胞后，会通过多种机制来逃避宿主细胞的免疫及降解作用，进而实现在细胞内定植生存。在细菌侵入细胞后，首先会被一个双层膜的液泡，即吞噬小体包裹。在这一过程中，放线菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，ACT)、李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，Lm)等可通过溶解双层膜的吞噬小体进而在细胞中定植生存[2-3]；含有细菌的吞噬小体也可通过内源性途径转运至自噬小体从而进入自噬途径，此时如牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)、流产布鲁氏菌(Brucellaabortus，Ba)和嗜肺军团菌(Legionellapneumophila，Lp)等便可通过对自噬小体进行修饰调节，影响自噬途径的正常进行，阻碍自噬小体与溶酶体融合而影响自噬过程中的降解作用，实现自噬逃逸，进而实现细菌在宿主细胞内定植生存[4-6]。本文将以Pg侵入正常牙龈细胞或食管上皮细胞为例，对外来病原菌侵入细胞后转运至自噬途径并发生自噬逃逸这一过程进行综述，总结Pg在细胞内定植生存及增殖的机制。

1 自噬

1.1 细胞与自噬

自噬是一种细胞内的重要生理活动，用于降解受损细胞器和细胞质组分，以维持其稳态。从形成自噬小体到自噬小体向溶酶体转运最终形成自噬溶酶体，这一过程是细胞新陈代谢、发挥其降解作用、清除细胞质组分及受损细胞器所必须的。其中自噬过程中被降解的细胞质组分特指在细胞分化、应激效应或暴露于细胞毒素等因素造成的受损胞内组分；被降解的细胞器特指在细胞受损或刺激后导致自身细胞器结构破坏及功能受损的细胞器[7-8]。目前已有大量研究证实了这一现象，比如，脑肝肾综合征患者体内细胞中所形成的异常过氧化物酶体就是通过自噬途径而被降解[9]。在镇静剂苯巴比妥摄入后引起肝脏细胞内质网的异常增殖、安妥明等降血脂药物摄入后引起过氧化物酶体的异常增殖等现象中，一旦终止药物的摄入，这些异常增殖的细胞器便会通过自噬途径而被降解掉[10-11]。当细胞处于营养不良状态时，通常通过对自身细胞内组分的非选择性降解，摄取其中的碳水化合物和氨基酸等营养物质维持机体内环境的稳态[12]。自噬本身就是细胞内天然的维持机体稳态的一种重要的生理活动，在细胞受到刺激或处于营养不良状态(缺乏氨基酸/生长因子等)时，细胞内的自噬活性会进一步得到加强[13]。在他莫昔芬治疗乳腺癌的研究中发现，细胞可在药物的作用下诱导体内自噬的发生，进而对癌细胞进行降解[14]。尽管自噬是可以高度调节地发挥降解作用的一种内源性途径，但目前已有研究报道，在一些因缺乏生长因子而死亡的神经元以及X连锁肌小管性肌病中，发生了不受自噬调控的细胞器降解甚至死亡的现象[15-16]。

早期自噬小体是一个由糙面内质网分泌的多层膜结构的液泡，其中包裹着尚未降解的受损细胞器以及细胞质成分[17-18]。随后早期自噬小体通过获得MAP-LC3微管结合蛋白以及溶酶体膜蛋白HsGsa7p和LAMP-1后演化为后期自噬小体，此时的自噬小体仍缺乏蛋白水解酶而无降解作用，须转运至溶酶体并在微管蛋白介导下与溶酶体融合形成自噬溶酶体，进而发挥自噬途径中的降解作用，对其中的细胞质成分及受损细胞器进行降解，所得降解产物还可为细胞内正常代谢活动提供能量[13]。

1.2 自噬相关的分子机制

肌动蛋白、异三聚体G蛋白、Ⅲ类磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及其伴随的p150蛋白等均为自噬小体形成及成熟过程所必须的分子[19]。此外，机体内同样也存在抑制自噬发生的途径，如FRAP/mTOR，是一种磷脂酰肌醇/蛋白激酶，可通过调节核糖体S6蛋白磷酸化水平升高而促进机体内蛋白质合成[20]，抑制自噬的发生[21]；Ⅰ类PI3K蛋白同样也是自噬的一个负性调节蛋白[22]。还有文献指出，由E1泛素激酶激活的一种蛋白结合系统同样也是自噬小体形成所必须的[23]，这种蛋白结合系统已证明在包括人类在内的所有真核生物中均有存在[24-25]。目前已在酵母和哺乳动物细胞中证明，E1泛素激酶家族中的Gsa7p/Apg7p[23]，可通过催化Apg12p与Apg5p蛋白结合、Apg8p与磷脂酰乙醇胺结合调节自噬小体的形成及成熟过程[26]。Apg12p与Apg5p结合所形成的蛋白复合物可通过调节糙面内质网分泌自噬小体前体这一过程影响自噬小体的形成；Apg8p作为一种脂溶性蛋白，可与自噬小体膜结合，是自噬小体成熟过程中的一个关键蛋白，与人类MAP-LC3蛋白是同系物且均可定位于自噬小体的外膜上[27]。MAP-LC3蛋白可定位于自噬小体的外膜上，是自噬小体形成的标志，一旦加入渥曼青霉素、3-甲基腺嘌呤等抑制剂抑制自噬的发生，可发现MAP-LC3表达量明显降低[27]。人类同源的Gsa7p和HsGsa7p蛋白可以促进hApg12p与MAP-LC3蛋白结合，进一步证明了蛋白结合系统对真核生物的自噬过程能够起到一定的调控作用[24,28]。自噬小体形成后需要与溶酶体结合形成成熟的自噬小体，在微管蛋白、LAMP-2和SNAREs蛋白的共同作用下[19,29]，通过招募V-ATPase和溶酶体蛋白LAMP-1至自噬小体外膜，随后与溶酶体融合形成富含酸性水解酶的成熟自噬小体，即自噬溶酶体进而发挥其降解作用。

1.3 细菌感染与细胞自噬

许多细菌已经演化出多种入侵真核细胞并在细胞内发生定植、增殖的机制[1]。细菌进入细胞后首先会被吞噬小体包裹，接着在Rab GTPases蛋白的调控下介导吞噬小体与核内体发生动态转运，进而与溶酶体融合形成成熟的吞噬小体即吞噬溶酶体，发挥其降解作用[30-31]。吞噬溶酶体中富集大量蛋白水解酶，促使其包裹的大多数病原体的死亡和降解，抵御了胞内病原体的进一步扩增。而一些研究发现进入胞内的病原体可通过干扰吞噬小体向吞噬溶酶体成熟这一过程，逃逸宿主细胞的降解作用，以实现病原体在胞内的定植生存。如包裹结核杆菌的吞噬小体，由于缺乏V-ATPase，使得吞噬小体无法与溶酶体结合而形成成熟吞噬小体的过程，继而使得结核杆菌在胞内逃逸被降解的过程，实现在胞内的定植生存[32]。因此，一些进入胞内的病原体可能通过干扰吞噬小体的形成及成熟过程而逃逸宿主细胞的降解作用，进而实现在胞内定植生存。

进入胞内后的病原体除了被吞噬小体转运至溶酶体之外，还能被转运至自噬小体进入自噬途径。如Pg感染食管上皮细胞，在加入渥曼青霉素或3-甲基腺嘌呤等抑制剂预处理食管上皮细胞后，再用Pg感染细胞发现，细菌在胞内无一存活[6,20,33-34]。这些数据表明外来病原体进入胞内后，通过刺激细胞的自噬发生，使得病原体侵入细胞后由吞噬小体转运进入自噬途径，继而在自噬过程中逃逸宿主细胞的降解作用，实现在胞内的定植生存。目前已经有研究表明自噬水平会随着侵入病原体的增多而升高[35]。此外还有研究发现细胞在受病原体感染引起的细胞自噬中，其中的自噬相关蛋白HsGsa7p的分布明显不同于由饥饿而引起的细胞自噬。在细胞由饥饿而引起的自噬中，HsGsa7p蛋白相对分散，分布于整个细胞质当中，当加入渥曼青霉素抑制自噬途径时，HsGsa7p蛋白则定位于高尔基体上。在细胞由病原体感染而引起的自噬中，HsGsa7p聚集明显，附着于自噬小体外膜上。当加入渥曼青霉素抑制自噬途径时，HsGsa7p同样定位于高尔基体上[36]。因此，进入胞内的病原体同样也可能通过干扰自噬小体的形成及成熟过程摆脱其被降解的命运，进而实现在胞内定植生存。

2 细菌侵入细胞后能够向自噬小体转运

目前对于细菌在侵入细胞后是直接被转运至溶酶体中进行降解还是进入自噬途径，仍没有一个明确的结论。如Pg在其进入细胞被包裹于吞噬小体后，能直接向自噬小体转运进入自噬途径，而不是直接被溶酶体降解，进入自噬途径后的Pg就能够利用自身的Ⅸ型蛋白分泌系统对自噬小体进行修饰调节[37]，利用自噬小体所包裹的内源性蛋白为其在胞内定植生存供给能量[38-40]；此外如嗜肺假单胞菌，在侵入细胞后被吞噬小体包裹，可通过icm/dotⅣ型蛋白分泌系统介导下转导顺式作用信号，激活自噬途径，将细菌由吞噬小体向自噬小体转运并在自噬过程中诱发自噬逃逸，最终实现在胞内的定植及增殖[41-43]；Ba同样也可以在icm/dotⅣ型蛋白分泌系统的介导下实现其在胞内的定植及增殖[44-45]。这些研究说明细菌侵入细胞被吞噬小体包裹后，可以通过一系列蛋白分泌系统激活自噬途径，介导细菌从吞噬小体向自噬小体转运，并诱发自噬逃逸，最终实现细菌在胞内定植增殖[46]。而如果细菌进入细胞后没有自身蛋白分泌系统的调控，那么细菌进入细胞被吞噬小体包裹后将直接转运进入自噬途径，激活自噬的发生，由自噬小体将外来细菌包裹起来，并通过自噬途径转运到溶酶体中形成自噬溶酶体，发挥对细菌的降解作用。自噬常会因外界病原体感染、高温、辐射、饥饿、药物等作用而被激活[14,47-49]。因此，受到外来病原体侵入的细胞均可通过激活自噬途径形成自噬小体，并与溶酶体结合形成自噬溶酶体，在蛋白水解酶的作用下实现对外来病原体的清除降解作用。

3 细菌在自噬小体中发生自噬逃逸

正常情况下，细菌进入细胞质后首先会被吞噬小体所包裹，继而再通过与核内体相互作用演化成具有核内体特征的液泡，随后通过与溶酶体结合，在溶酶体水解酶的作用下实现宿主细胞对胞内细菌的降解[22]。然而对于Pg而言，在进入细胞后能够通过吞噬小体迅速与早期核内体结合，随后向自噬小体转运，而避免了进入细胞后直接被溶酶体降解的命运[6,50-51]。包含细菌的核内体能够向自噬小体转运这一现象说明细胞内存在着介导内吞与自噬相互作用的机制[9,17,52]，这一机制同样也介导核内体与自噬小体的融合[53]。核内体与自噬小体融合，揭示了Pg进入细胞后向自噬小体转运的这一重要途径。

早期的自噬小体是由糙面内质网(rough endoplasmic reticulum，RER)内陷而形成的具有多层膜结构的液泡，包裹着尚未降解的细胞质成分及受损的细胞器[13]。利用免疫荧光方法检测Pg侵入细胞后与内质网蛋白的共定位实验中发现，胞内的细菌与内质网蛋白存在大量的共定位现象[6,54]，说明侵入细胞后的细菌能够与早期自噬小体结合。此外Garin还利用免疫荧光检测了胞内细菌和内质网中其他与核内体相关的蛋白(钙网蛋白、钙联接蛋白、GRP78、Erp29)的共定位情况，发现胞内细菌能够与内质网蛋白结合产生共定位的同时，还改变了内质网在细胞质中的分布：被细菌感染后的细胞在其细胞质中可见自噬小体周围富集了大量内质网，而未被细菌感染的细胞其自噬小体周围并未发现内质网。

HsGsa7p作为一种介导早期自噬小体形成的关键蛋白，在免疫荧光实验中，检测在经Pg感染后的细胞中胞内细菌与HsGsa7p共定位的实验中发现[6]，HsGsa7p同样也能与胞内细菌发生大量共定位。随着自噬小体的成熟，HsGsa7p与Pg的共定位逐渐减少。当加入渥曼青霉素抑制自噬的发生时，可见Pg与溶酶体蛋白cathepsin L发生大量共定位。这表明，HsGsa7p作为自噬小体的关键蛋白，同样也是在细菌通过自噬途径建立细菌生存所需的微环境这一过程中的重要因子。

4 Pg自噬途径与胞内定植、增殖

4.1 Pg通过自噬途径在胞内定植

在早期自噬小体成熟过程中，通过获得一个溶酶体相关的膜蛋白LAMP-1(同样也被称作溶酶体糖蛋白-LGP120)和一个保留糙面内质网蛋白的V-ATP酶从而形成后期自噬小体。后期自噬小体通过与溶酶体结合形成成熟的自噬小体即自噬溶酶体，由其中的酸性水解酶对自噬小体中的内容物进行降解[17]。自噬溶酶体是单层膜结构，包含着被降解的细胞器及细胞质成分，其降解内容物后所产生的多肽及氨基酸可重新回收利用合成新的蛋白。然而对于Pg而言，在其感染细胞后，会通过阻碍自噬小体与溶酶体结合形成自噬溶酶体这一过程来实现自噬逃逸，避免被降解。Pg在侵入细胞后在一个由单层膜包裹的液泡中实现在胞内的定植及增殖，且该液泡周围无后期自噬小体标志蛋白LAMP-1和溶酶体标志蛋白cathepsin D附着，表面仅有糙面内质网蛋白附着，此时的单层膜液泡很可能是一个被细菌修饰后的自噬小体，无法再与溶酶体结合形成自噬溶酶体，发挥其降解作用[6]。此外根据嗜肺假单胞菌感染细胞后的免疫荧光实验结果显示[55]，嗜肺假单胞菌周围有大量后期自噬小体标志蛋白LAMP-1和溶酶体标志蛋白cathepsin D附着，也就意味着嗜肺假单胞菌侵入细胞进入自噬途径后，很可能是被转运至自噬溶酶体中，通过对自噬溶酶体进行调节修饰，从而避免被宿主细胞降解实现自噬逃逸。因此外来细菌病原体侵入细胞后，不仅能在自噬小体中发生逃逸，还能在富集多种水解酶的自噬溶酶体中发生自噬逃逸，进而实现在胞内定植。

4.2 Pg通过自噬途径在胞内增殖

细菌侵入细胞后转入到自噬途径，不仅逃避了直接被宿主细胞降解清除的命运，实现自噬逃逸，同时在自噬小体中还能募集蛋白底物，为细菌在胞内的增殖代谢等活动供给能量。尤其是对于Pg而言，其在胞内定植需要大量多肽和氨基酸作为碳源，为其增殖代谢活动提供能量[10,12]。而细菌在胞内运转，对真核生物的正常生理功能也造成了影响。

基于含有Pg的自噬小体因无法与溶酶体融合而缺乏酸性水解酶发挥其降解作用这一现象，细菌在胞内自噬过程中对蛋白底物的招募很可能是通过细菌自身的蛋白激酶来进行。有研究报道，Pg在侵入人类冠状动脉上皮细胞后，与未感染细菌的人类冠状动脉上皮细胞相比，长寿内源性蛋白酶的量明显增加[56]。此外在含有Pg的后期自噬小体内可观察到大量分泌液泡富集，这是由于Pg的牙龈孢囊正在分泌并传递其蛋白酶至自噬小体中摄取胞内蛋白为自己供能[57]，同时这也是一种细菌降解并摄取宿主细胞蛋白为自己在胞内生存所必要的方式。这些蛋白酶大部分被包裹于后期自噬小体中，为宿主细胞供能并维持宿主细胞活力。对于Pg而言，可能是通过自身的蛋白酶降解并摄取宿主细胞中的蛋白作为碳源，为它们在胞内的代谢活动提供能量。因此，侵入胞内的Pg可能是通过在自噬小体中降解并摄取其中的细胞质成分及受损细胞器成分中的多肽，从而为其在胞内的代谢活动提供营养，供给能量。

5 结论与展望

细菌侵入细胞后，可以通过逃避宿主细胞的降解作用来实现胞内定植，大部分的细菌都是被包裹于吞噬小体，通过阻碍吞噬小体向溶酶体转运这一过程来逃逸宿主细胞的降解。Pg在进入细胞被吞噬小体包裹后，能够向自噬小体转运而非溶酶体，进入自噬途径后，通过吞噬小体与自噬小体融合，促进早期自噬小体的形成，将Pg连同细胞质内蛋白一起包裹于早期自噬小体中。随着早期自噬小体上不断富集大量溶酶体膜蛋白，便完成了由早期自噬小体向后期自噬小体进化的过程。包裹着Pg的后期自噬小体可通过与溶酶体结合获得其中的酸性水解酶，形成成熟的自噬小体，即自噬溶酶体，发挥对其内容物的降解作用。而一旦自噬途径受到PgⅨ型蛋白分泌系统的调控修饰作用，包裹着Pg的后期自噬小体便无法与溶酶体融合形成自噬溶酶体，反而在自噬小体内形成了适宜Pg在胞内定植生存的微环境，同时Pg可通过自身的蛋白激酶降解并摄取自噬小体中所包裹的细胞质成分，为Pg在胞内的定植生存提供能量。

若将待感染的细胞中加入阻碍自噬发生的药物或抑制剂，再用Pg感染细胞可发现胞内细菌活力明显下降，此时的细菌进入细胞后仍被包裹于吞噬小体中，但由于自噬途径受到抑制，此时胞内的细菌只能在吞噬小体的作用下被转运至溶酶体中进行降解，最终被宿主细胞清除。因此对于Pg而言，侵入细胞后，只有通过进入自噬途径在蛋白分泌系统的作用下对自噬小体进行一系列调控修饰，才能避免被宿主细胞降解，实现自噬逃逸。这一机制为清除Pg提供了新思路：在Pg感染细胞后，使用药物或抑制剂阻碍细胞自噬的发生，便能够大大降低Pg的活力，阻碍其在胞内定植生存。

目前仍有一些细菌在胞内的定植生存机制尚未揭示，有些可能仍与自噬途径有着密不可分的关系。在由细菌侵入细胞而引起的自噬逃逸中所涉及的蛋白及细胞器也仍需继续探索和验证。可以通过对病原菌在胞内定植生存的机制及其相关蛋白等方面进行研究，加深对病原菌发生自噬逃逸相关机制的理解，同时也为临床相关治疗提供新的方向和思路。