六灵解毒丸对急性咽炎的治疗作用研究 *

高雨嫣，束安梅，朱逸晖，姚瑶，龚剑，吕高虹，王恒斌，罗年翠，许惠琴

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023；3.雷允上药业集团有限公司，江苏 苏州 215009)

急性咽炎在中医学中被称为“急喉痹”，在古代文献中多以喉痹为名出现，临床多见风热外袭型急喉痹，症状多为咽喉肿痛、吞咽不利等[1]。现代医学研究表明，急性咽炎一般是由细菌或病毒或环境变化，喜食刺激辛辣食物而引起炎症[2-3]。炎症可以波及整个咽部，或局限于鼻咽、口咽或喉咽的一部分，患者多有咽干、咽部灼热、咽黏膜充血、咽痛等症状[4]。六灵解毒丸是由人工牛黄、珍珠、石菖蒲、雄黄、蟾酥等药经加工制成的微丸，具有清热解毒、消肿止痛的作用[5]，临床治疗小儿急性咽炎具有良好的疗效。为了揭示其治疗机理，本实验采用氨水刺激法建立幼龄大鼠急性咽炎模型，同时采用小鼠毛细血管通透性实验与耳肿胀实验，观察其抗炎作用特点，为其临床治疗有效性提供依据。

1 材料

1.1 药物及试剂

六灵解毒丸，由雷允上药业集团有限公司提供，批号：RAO2001。蓝芩口服液，扬子江药业集团有限公司，批号：19010422。生理盐水，中国大冢制药有限公司，批号：1901101。25%氨水，国药集团化学试剂有限公司，批号：20190705。多聚甲醛，Servicebio公司，批号：XS191316。IL-1β抗体，Abcam公司，批号：GR309542-28。IL-6抗体，Abcam公司，批号：GR3190303-16。TNF-α抗体，Abcam公司，批号：GR3272631-3。IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：201912，规格：96T。β-actin抗体，Bioworld公司，批号：AA1217J7525ACTB1。辣根酶标记山羊抗兔二抗，Cell Signaling公司，批号：28。辣根酶标记山羊抗小鼠二抗，BOSTER公司，批号：7074P2。RIPA裂解液，索莱宝科技有限公司，批号：R0020。PMSF，索莱宝科技有限公司，批号：P0100。

1.2 动物

SPF级SD大鼠、SPF级ICR小鼠，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，生产许可证号：SCXK(苏)2017-0001。以上实验动物使用单位为南京中医药大学，使用许可证号：SYXK(苏)2018-0049。实验动物伦理号：201908A019，201910A030。以上动物均饲养于南京中医药大学实验动物中心，雌雄分笼，用鼠颗粒饲料喂养，自由饮水，室温20～23 ℃，湿度44%～57%。

SPF级实验鼠颗粒饲料，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

1.3 仪器

咽喉给药器，江苏平安医疗器械有限公司。TD6001电子天平，天津市天马仪器厂。FA2104电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司。Direct-Q超纯水仪，美国MILLIPORE公司。台式高速冷冻离心机，购自美国贝克曼公司。Synergy HT酶标仪，美国Bio-Tek公司。

2 方法

2.1 六灵解毒丸对氨水诱发的幼龄大鼠急性咽炎的治疗作用研究

2.1.1 分组、造模以及给药 取幼龄SD大鼠50只，体质量100～120 g，雌雄各半，用喉头喷雾器将15%的氨水向大鼠咽部喷雾(散布面积150 mm2)，每天上下午各1次，每次喷3下(0.3 mL)，连续喷3 d。使大鼠咽部黏膜因氨水急性刺激而出现明显红肿以形成急性咽炎模型。造模后次日，将大鼠随机分为5组，即模型组：生理盐水10 mL/kg；蓝芩口服液组：5 mL/kg(相当于临床等效剂量)；六灵解毒丸3个剂量组：4.375、8.75、17.5 mg/kg(相当于临床等效剂量的0.5倍、1倍、2倍)。各组每天灌胃给药1次，连续7 d。同时另取10只大鼠(雌雄各半)作为空白组，每天灌胃给予生理盐水1次，连续给药7 d。末次给药后大鼠隔夜禁食12 h，用0.3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min，取血清-80 ℃冰箱保存备用。并取咽黏膜下的结缔组织备用。

2.1.2 大鼠体征、体质量情况 造模及给药期间每天观察大鼠的体征变化，如皮毛光泽度、皮毛脱落情况、活动情况、垫料洁净情况、饮食情况等，并在造模前、造模后、给药后分别测定大鼠的体质量。

2.1.3 大鼠咽喉局部情况 造模及给药期间每天观察大鼠的咽喉部位色变情况，如咽喉部红肿程度、颜色深浅等。大鼠咽部红肿程度评分标准如下[6]：①-：咽部无异常，计0分；②+：咽部略有泛红，计1分；③++：咽部有明显红肿充血的现象，且大鼠时常抓挠，计2分；④+++：咽部有明显红肿充血的现象，且有溃烂处，计3分。

2.1.4 大鼠咽部组织的病理变化 取大鼠咽部组织，于4%甲醛溶液中固定，梯度乙醇逐步脱水，用纯二甲苯透明组织，纯石蜡包埋凝固，4 ℃存放，备用。修块，并切片，每一片约4 μm，烤片过夜，HE染色，用中性树脂封片，并在光镜下观察每组大鼠咽喉组织病变程度，按病变程度记为1分(轻度)，2分(中度)，3分(重度)。

2.1.5 六灵解毒丸对大鼠血清和组织中炎症因子的影响 将大鼠麻醉，取腹主动脉血，离心，取上清(血清)后，按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，用多功能酶标仪检测吸收度。

处死大鼠后，取部分大鼠咽部组织，采用免疫组化法：石蜡切片脱蜡至水→抗原修复→阻断内源性过氧化物酶→BSA封闭→加一抗4 ℃过夜→PBS洗涤→加二抗室温孵育50 min→DAB显色→复染细胞核→脱水封片→显微镜镜检→图像采集分析检测大鼠咽部组织中IL-1β、IL-6、TNF-α，利用Image J软件进行定量。

取部分大鼠咽部组织，加入RIPA裂解液，提取大鼠咽部组织蛋白，加入上样缓冲液，95 ℃金属浴5 min后备用。SDS-PAGE凝胶电泳后，转移到PVDF膜上，加入BSA(0.5 g/L)室温封闭2 h，然后加入一抗，4 ℃过夜。第2天，用PBST洗膜4次，每次15 min。分别加入二抗，室温孵育2 h后，再用PBST洗膜4次，每次15 min，ECL显色。以β-actin作为内参，利用Image J软件分析IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的灰度值，进行计算定量。

2.2 小鼠毛细血管通透性实验

取ICR小鼠72只，体质量18～20 g，雌雄各半。按体质量随机分为6组：空白组，模型组，蓝芩口服液组，六灵解毒丸3个剂量组(8.75、17.5、35 mg/kg)，各组按10 mL/kg每日灌胃给药1次，空白组与模型组用等量的生理盐水灌胃，连续给药3 d。末次给药30 min后，尾静脉注射0.5%伊文思蓝0.01 mL/g，同时每只小鼠腹腔注射0.2 mL 0.6%乙酸。20 min后脱颈椎处死小鼠，用5 mL生理盐水冲洗腹腔，用注射器抽出腹腔洗液约4.5 mL。2 000 r/min离心5 min。于590 nm处测定腹腔洗液吸光度(OD)值[7]。

2.3 小鼠耳肿胀实验

取体质量为25～27 g的ICR雄性小鼠60只，按体质量随机分为5组：对照组，蓝芩口服液组，六灵解毒丸3个剂量组(8.75、17.5、35 mg/kg)，各组按10 mL/kg每日灌胃给药1次，对照组用等量的生理盐水灌胃，连续给药3 d。末次给药30 min后用二甲苯40 μL涂于小鼠左耳两侧。在致炎1 h后处死小鼠，剪下左右两耳，用打孔器(直径9 mm)分别在同一部位取下圆耳片，电子天平称耳片质量，并比较各组小鼠耳肿胀度(左耳片质量-右耳片质量)，计算小鼠耳肿胀度和肿胀抑制率[8]。肿胀抑制率计算公式如下：肿胀抑制率=(对照组平均耳片肿胀度-给药组平均耳片肿胀度)/对照组平均耳片肿胀度×100%。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠体征、体质量观察

造模前，所有大鼠状态均良好。空白组状态正常，毛色光亮，活动正常。造模后大鼠出现精神状态欠佳并懒动，体毛凌乱无光泽，频饮水，纳食少，口腔分泌物增加，体质量增加缓慢，并出现动物死亡的现象。给予蓝芩口服液、六灵解毒丸后，大鼠体征明显改善、体质量增加速度加快，结果见表1。

3.2 大鼠咽喉局部情况

造模3 d后大鼠咽喉部均出现++至+++的红肿，表明模型成功。给予蓝芩口服液和六灵解毒丸后，大鼠咽喉红肿程度降低，其中以六灵解毒丸中、高剂量组治疗效果较好，且六灵解毒丸中、高剂量组与蓝芩口服液组间有显著差异(P<0.05)。结果见表2。

表1 六灵解毒丸对氨水刺激幼龄大鼠体质量的影响

表2 六灵解毒丸对氨水刺激幼龄大鼠咽喉红肿评分的影响

3.3 大鼠咽部组织的病理变化

实验结果显示，空白组大鼠咽部组织结构正常，如图1A所示，气管黏膜层无明显脱落、损伤，黏膜下层腺体结构正常，未见结缔组织增生，未见炎症细胞浸润。模型组大鼠咽部组织结构异常，如图1B所示，部分黏膜下层区域可见大量结缔组织增生，如黑色箭头所示;该区域黏膜上皮细胞严重增生，黏膜层明显增厚，如黄色箭头所示；黏膜下层可见少量细胞坏死，如绿色箭头所示；少量炎症细胞浸润，如红色箭头所示。给予蓝芩口服液(图1C)和六灵解毒丸(图1D～F)之后，大鼠咽部组织结构有明显改善，大鼠咽部组织结构与黏膜下层腺体结构有所恢复，气管黏膜层偶有脱落、损伤，少见结缔组织增生与炎症细胞浸润，其中六灵解毒丸中、高剂量组的改善作用更明显(P<0.01)。

3.4 六灵解毒丸对大鼠血清和组织中炎症因子水平的影响

实验结果显示，给予幼龄大鼠氨水刺激后，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显上升(P<0.01)。而与模型组相比，所有给药组均可明显下调大鼠血清中的IL-1β、TNF-α水平(P<0.05～0.01)，以六灵解毒丸高剂量组效果较佳；六灵解毒丸中、高剂量组可明显下调大鼠血清中的IL-6水平(P<0.05～0.01)。免疫组化和Western blot结果也显示,模型组大鼠组织中的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显上升。与模型组相比，蓝芩口服液组和六灵解毒丸中、高剂量组可不同程度地下调大鼠组织中的IL-1β、IL-6、TNF-α水平，以六灵解毒丸高剂量组较佳。如图2～6所示。

3.5 六灵解毒丸对乙酸所致小鼠毛细血管通透性的影响

实验结果显示，蓝芩口服液、六灵解毒丸中、高剂量组均可明显降低乙酸所致小鼠毛细血管通透性，与模型组比较均有明显差异(P<0.05～0.01)。见表3。

3.6 六灵解毒丸对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

实验结果显示，在二甲苯致炎作用下，各组小鼠左耳均出现肿胀，而中、高剂量六灵解毒丸均可降低耳肿胀度，与对照组比较差异显著(P<0.05～0.01)，且随剂量的增加，耳肿胀的抑制作用更明显。同时也发现，六灵解毒丸中、高剂量组抑制耳肿胀作用强于蓝芩口服液组，与蓝芩口服液组比较具有显著性差异(P<0.05)。见表4。

表3 六灵解毒丸对乙酸所致小鼠毛细血管通透性的影响

表4 六灵解毒丸对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

4 讨论

急性咽炎临床上以西药治疗为主，多用抗生素，如青霉素等，但是易产生耐药性。传统医学认为，五脏六腑之“火”都会上冲口喉部位，正所谓“咽喉口齿诸病，皆属于火”。咽喉的红肿、疼痛、化脓等均归为“火”的表现。故本病宜采用疏风解表、清热解毒的方法治疗。六灵解毒丸的主药人工牛黄可解热镇痛、抗病原微生物[9]，临床用于治疗咽喉肿痛，口舌生疮，痈肿疔疮。

炎症是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍[10]，其病变虽然多在局部，但特殊部位炎症会导致并发症出现，如严重的心肌炎可导致心脏功能受损[11]。IL-1β、IL-6、TNF-α均为急性炎症相关的重要指标。IL-1β、IL-6能促进B细胞增殖、分化并产生抗体，诱导细胞发生炎症[6,12]，TNF-α是炎症级联反应中重要的炎症因子，其水平升高可介导炎症反应[13]。三者可相互促进，使炎症细胞聚集、活化和释放炎症介质，加重炎症症状[14]。据文献报道，氨水喷雾可使大鼠咽喉部因急性刺激而充血肿胀，形成急性炎症，该模型能够维持10 d[15]。故本研究采用氨水喷雾刺激的方法制备幼龄大鼠急性咽炎模型。

近年来研究发现，人工牛黄对醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增加以及肉芽组织增生均有抑制作用，另外还可以减轻电刺激、热刺激、醋酸等导致的小鼠疼痛[9,16]。故本实验建立了乙酸所致小鼠毛细血管通透性增加的模型以及二甲苯致小鼠耳肿胀的模型。结果表明，六灵解毒丸中、高剂量均可明显降低乙酸所致小鼠毛细血管通透性，并能够降低耳肿胀度，与对照组比较差异显著(P<0.05～0.01)，且随剂量的增加，耳肿胀的抑制作用更明显，六灵解毒丸中、高剂量组抑制耳肿胀作用略强于蓝芩口服液，2组比较具有显著性差异(P<0.05)。说明六灵解毒丸对化学性刺激导致的炎症也有一定的对抗作用。

综上所述，本研究对六灵解毒丸治疗急性咽炎进行了药效研究，证实了六灵解毒丸对于化学刺激所致的急性咽炎具有良好的治疗作用，其机制可能与下调IL-1β、IL-6、TNF-α水平相关，为后续的临床推广应用积累了良好的学术证据。