紫荆皮提取物抗类风湿性关节炎作用的研究

胡 诚，贾益群

（上海中医药大学科技实验中心，上海 201203）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节炎症为主的慢性反复发作的全身性疾病［1-4］。我国传统中医学认为RA是以虚实兼杂为主要表现的虚损性疾病,根据临床表现属于中医学“痹症” 的范畴。《内经》 中列出了关于痹症的专论——《痹论》 《周痹》 中最早提出了风寒湿邪与机体外内相合致痹的观点：“风寒湿三期杂至合而为痹也”；“所谓痹者,多以其时重感风寒湿之气也”。这些理论与当代医学对RA发病机制的认识颇为相符。目前治疗RA的药物如布洛芬、依托度酸、糖皮质激素长期服用具有毒性,表现为肝肾功能损害、高血压、骨质疏松等。而中药雷公藤［5-6］、青风藤、马钱子、乌头［7-8］等治疗RA的中药也均存在高毒性和免疫抑制作用。

紫荆皮具有活血行气、清热解毒、消肿止痛等功效,临床用于治疗风寒湿痹、妇女经闭、血气疼痛、痈肿、跌打损伤、蛇虫咬伤等病症。李时珍论紫荆皮活血消肿解毒之功：“紫荆气寒味苦,色紫性降,入手足厥阴血分。寒胜热,苦走骨,紫入营,故能活血消肿,利小便而解毒。杨清叟《仙传方》 有冲和膏,以紫荆为君,盖得此意也。”据文献报道,紫荆皮煎剂灌注对二甲苯所致小鼠耳肿胀及角叉菜胶所致小鼠足肿胀均有显著抑制作用,并能明显抑制醋酸所致小鼠扭体次数［9-10］。因此,紫荆皮是一个潜在的、安全无毒的治疗RA的药物,并对其进行研究。大鼠佐剂型关节炎模型能够在一定程度上模拟人RA的发病机制,具有许多相似特征,常用作研究RA的病理模型［11-13］。

1 材料

1.1 仪器 1290-6530液相串联飞行时间质谱联用仪（美国安捷伦公司）；N-1001型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；BSA 224S电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；HHS型恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏仪器有限公司）。

1.2 药物与试剂 紫荆皮药材（上海虹桥饮片厂）；乙腈（色谱纯,美国Fisher公司）；超纯水（美国Millipore公司）；甲酸（色谱级,Mreda technology公司）；吲哚美辛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲苯、0.6%醋酸溶液（国药集团化学试剂有限公司）；完全弗氏佐剂（CFA）（美国Sigma公司）。

1.3 动物 ICR小鼠,体质量（20±2）g,雄性,100只；雄性Wistar大鼠,清洁级,体质量（150±20）g,上海中医药大学动物实验中心,动物生产合格证SCXK （沪）2018-0005,动物伦理编号为PZSHUTCM190315014。

2 方法

2.1 提取方法 取紫荆皮药材10 kg,分别使用水、75%乙醇和95%乙醇回流提取2次,每次2 h,滤过,合并滤液,减压回收溶剂,于真空恒温干燥箱中80 ℃干燥3 h至恒重,计算浸膏得率。

2.2 提取物UPLC-Q-tof全扫图谱 分别取出相当于1 g药材的3种供试品浸膏：（1）水提浸膏0.143 g；（2）75%乙醇提取浸膏0.201 g；（3）95%乙醇提取浸膏0.181 g,使用10 mL甲醇定容,15 000 r/min离心10 min后取上清,进样1 μL分析。分析条件为色谱柱C18Hypersil （100×2.1 mm,1.9 μm）；流动相0.05% 甲酸水溶液 （A）-0.05%甲酸乙腈溶液（B）,梯度洗脱（0～1 min,5% B；1～7 min,5%～50% B；7～15 min,50%～60% B；15～20 min,60%～70% B；20～25 min,70%～80% B；25～28 min,80%～95%B）；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃。质谱条件为采用电喷雾电离离子源（ESI）,参数设置如下,毛细管电压为3.0 kV （ES+）、2.9 kV （ES-）,m/z范围为50～1 000；锥孔电压40 kV；离子源温度100 ℃；脱溶剂温度450 ℃；脱溶剂气体流速900 L/h；锥孔气流量50 L/h；V模式检测；甲酸钠校正。通过MassLynx V4.1质谱工作站（Waters）采集数据和输出数据。

2.3 小鼠急性抗炎药效初筛 取ICR小鼠50只,随机分为5组,每组10只。各组小鼠按5 g生药/kg灌胃给药,阳性药给予吲哚美辛,10 mg/kg,连续3 d。末次给药30 min后分别精密吸取均匀二甲苯涂布于各鼠右耳上、下两面,剂量为20 μL,左耳不涂作对照。于涂耳30 min后,处死小鼠,沿耳廓基线剪下两耳,采用6 mm直径打孔器于左右耳对称部位打下耳片,用精密电子天平称取各鼠耳质量,并计算鼠耳肿胀率［肿胀率=（右耳质量-左耳质量）/左耳质量×100%］。

2.4 醋酸扭体法镇痛活性研究 取小鼠50只,随机分为5组,每组10只,按“2.3” 项中相同方式给药连续3 d。末次给药30 min后,每只小鼠腹腔注射0.6% 醋酸溶液0.2 mL,记录小鼠30 min内扭体反应次数。

2.5 紫荆皮总提物抗类风湿关节炎研究

2.5.1 大鼠造模及给药 将30只大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、甲氨蝶呤组、水提物组、75% 醇提物组,每组6只。大鼠适应性饲养1周后,在大鼠（正常组除外）右后足跖部皮内注射完全弗氏佐剂0.1 mL/每只致炎,并于第2天进行预防性灌胃给药,紫荆皮提取物剂量均为5 g生药/kg,阳性药甲氨蝶呤（MTX）,以0.5%CMCNa水溶液配成混悬液,剂量为3 mg/kg,模型组、正常组给予等剂量蒸馏水。每日1次,给药4周。

2.5.2 大鼠外观评估及体质量变化 给药后观察大鼠皮毛光泽度和精神状态,于第1、7、14、21、28天测定大鼠体质量,做好记录。

2.5.3 大鼠关节炎指数评分 从致炎后每隔3 d观察并记录各组大鼠后足关节及继发病变程度,每3天1次。每只足爪的关节炎指数评分标准：0为正常,无肿胀；1为踝关节轻微肿胀并出现红斑；2为踝关节到跖关节或掌关节轻微肿胀并出现红斑；3为踝关节到跖趾关节或掌关节中度肿胀并出现红斑；4为踝关节到趾关节重度肿胀并出现红斑。每只大鼠最多评12分。

2.5.4 大鼠足肿胀度的观察 用足容积测量仪测量每个大鼠左后足（非致炎侧）容积；致炎后于14、21、28 d测量左后足容积,求出继发侧足爪肿胀度。

2.5.5 胸腺和脾脏指数测定 胸腺和脾脏作为机体重要的免疫器官,其指数在一定程度上能反映机体免疫功能的强弱。于给药28 d后处死大鼠,取出器脾脏和胸腺,剔除脂肪和筋膜,挤尽血液,用滤纸吸干表面的液体并精密称量,分别计算其占体质量的比例（mg/g）。

2.5.6 血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含有量检测28 d后,取大鼠血浆静置2 h后,3 000 r/min离心10 min分离血清,分别按TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10试剂盒方法检测血清中上述指标含有量。

3 结果

3.1 紫荆皮提取物研究 结果发现使用水、75% 乙醇和95% 乙醇提取的浸膏得率分别为14.28%、20.12%、18.13%。质谱分析结果发现2种醇提方法得到的化学成分类似,且明显多于水提组。正负离子模式下总离子流图见图1。

3.2 紫荆皮提取物抗炎药效初筛 小鼠耳肿胀及醋酸扭体实验结果见图2,结果表明紫荆皮具有抗炎镇痛效果（P＜0.01）,且醇提物效果均好于水提物组。

3.3 紫荆皮总提物抗类风湿关节炎评价

3.3.1 大鼠外观评估 造模后大鼠精神萎靡、毛发暗淡、后足红肿,行动受限,24 h后足爪明显肿胀,12 d后模型组大鼠出现对侧足爪发生继发性病变,18 d后模型足大鼠普遍出现足爪红肿。给药组大鼠精神较好,进食正常,毛色有光泽,与正常组相似,原发性与继发性足均有轻微的红肿,其中以甲氨蝶呤组最轻,紫荆皮75%醇提物组次之。

3.3.2 大鼠体质量变化 造模后,大鼠体质量增长明显下降,与正常组比较具有显著性差异（P＜0.01）。给药后3周开始,甲氨蝶呤、紫荆皮水提物和醇提物组体质量增长与模型组比较均有显著性差异（P＜0.01）,但仍不及正常组。见图3A。

3.3.3 炎症指数评价 造模后,模型组炎症指数随病程延长而明显增加,于第12天开始明显高于正常组 （P＜0.01）；甲氨蝶呤、紫荆皮水提物和75% 醇提物组炎性指数增长较缓慢,与模型组比较均有显著性差异（P＜0.01）,但仍不及正常组。见图3B。

3.3.4 大鼠足肿胀程度 造模后大鼠足肿胀程度明显上升,在第14、21、28天对大鼠足容积的测量中发现,模型组大鼠足肿胀程度与正常组比较均有显著性差异 （P＜0.01）；给药组对大鼠足肿胀程度均有回调趋势 （P＜0.01）,其中以甲氨蝶呤组效果最好,紫荆皮75% 醇提物组比水提物组效果好。见图3C。

图1 3种提取浸膏的正负模式总离子流图

图2 紫荆皮提取物抗炎镇痛评价（n=8）

3.4 免疫器官指数评价 造模后大鼠的胸腺指数和脾脏指数显著性上升,与正常组比较有显著性差异（P＜0.01）；甲氨蝶呤治疗后给胸腺指数和脾脏指数显著性降低（P＜0.01）,而紫荆皮的水提物和醇提物组仅下调了脾脏指数（P＜0.01）,对胸腺指数下调不明显（P＞0.05）。见图4。

3.5 炎症因子检测 大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平见图5。模型组中TNF-α、IL-1β、IL-6均显著性升高,IL-10显著性降低,与正常组比较均有差异（P＜0.01）。给药后,甲氨蝶呤、紫荆皮水提物和75% 醇提物组均回调了模型组中升高的TNF-α、IL-1β、IL-6和降低的IL-10水平,且均具有显著性差异（P＜0.05,P＜0.01）,其中以甲氨蝶呤效果最好。

4 讨论

RA病因机制不明,无理想疗法［2-3］。本研究发现,紫荆皮提取物具有较好的抗炎镇痛活性,能够显著抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀和醋酸导致的小鼠扭体反应。进一步以大鼠佐剂型关节炎为研究模型,发现其还具有抗AA的作用。根据紫荆皮提取物的浸膏得率测定和UPLC-Q-TOFMS指纹图谱研究发现,紫荆皮醇提物化学成分明显多于水提物,这可能是其抗炎效果较好的原因。同时,紫荆皮醇提物对大鼠佐剂型关节炎模型的原发性和继发性足病变有显著抑制作用。此外,已有大量研究报道致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10在类风湿性关节炎中具有重要作用［14-16］,传统的类风湿关节炎治疗药物主要通过使用TNF-α、IL-1β、IL-6阻滞剂,干扰炎症和破坏性反应的疾病进程,以防止长期残疾［17-20］。本研究发现紫荆皮醇提物能有效地回调失衡的细胞炎症因子,使其趋于正常水平。综上所述,紫荆皮是一味有效且低毒的治疗RA的潜在药物,以期本研究结果为紫荆皮作为抗RA药物的开发利用提供药效药理依据,为其药效物质基础研究和作用机制的深入研究奠定基础。

图3 大鼠佐剂型关节炎评价（n=8）

图4 免疫器官指数（n=8）

图5 炎症因子含有量检测（n=8）