新型冠状病毒肺炎淋巴细胞亚群与严重程度的相关分析

包 芳，史尉利，胡 静，张 娣，高东晗，夏云霞，景红梅，克晓燕，葛庆岗，沈 宁△

(北京大学第三医院1.血液内科，2.运动医学研究所，3.呼吸与危重医学科，4.风湿免疫科，5.危重医学科，北京 100191)

目前，新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 19, COVID-19)已发展成为全球紧急公共卫生事件。该病会导致患者白细胞减少，伴淋巴细胞下降，但是淋巴细胞亚群如何变化，不同临床亚型淋巴细胞亚群是否存在差异，目前相关报道较少。为了更好地了解COVID-19，寻找有效的治疗方法，了解机体免疫系统对病原体的识别与应答，两者间相互作用机制及影响机体免疫识别与应答的因素尤为重要。本文拟明确不同临床亚型COVID-19患者组间淋巴细胞亚群差异，探讨疾病对人体免疫系统的影响，为COVID-19感染免疫机制提供临床数据资料。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究已通过北京大学第三医院医学伦理委员会批准，符合赫尔辛基宣言的原则。收集2020年2月8日至3月28日，在华中科技大学同济医学院附属同济医院中法新城院区由北京大学人民医院、北京大学第三医院及河南医疗队所负责的隔离病房符合确定诊断标准的COVID-19患者的临床资料。

纳入标准：(1)依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》诊断标准确诊为COVID-19的患者；(2)临床资料完善，有淋巴细胞亚群检测结果。排除标准：患血液系统疾病、慢性肾脏疾病需血液透析、肝硬化、多发伤、实体肿瘤等患者。

1.2 临床分型

对所有纳入患者检测淋巴细胞亚群，根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》进行临床分型，具体如下：(1)轻型：临床症状轻微，影像学未见肺炎表现。(2)普通型：具有发热、呼吸道等症状，影像学可见肺炎表现。(3)重型：符合下列任何一条：①出现气促，呼吸频率≥30次/min；②静息状态下，指氧饱和度≤93%；③动脉血氧分压/吸氧浓度≤300 mmHg。(4)危重型：符合以下情况之一者：①出现呼吸衰竭，且需要机械通气；②出现休克；③合并其他器官功能衰竭，需重症监护病房监护治疗。

检测方法：清晨取空腹静脉血送检验科检查血常规、淋巴细胞亚群、新型冠状病毒抗体。用血细胞仪计数外周血中淋巴细胞总数。用FACSCanto流式细胞仪对患者进行淋巴细胞亚群百分比分析[1]，不同淋巴细胞亚群的绝对数由淋巴细胞总数乘以淋巴细胞亚群百分比计算得出[2]。淋巴细胞亚群分析包括：CD3+CD19-T淋巴细胞、CD3-CD19+B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、NK细胞(CD3-/CD16+CD56+)、T+B+NK细胞的百分数及绝对数、CD4+/CD8+。

1.3 统计学方法

2 结果

三家援鄂医疗队负责的隔离病房共收治患者349例，其中91例进行淋巴细胞亚群分析检测，除外3例非COVID-19患者、3例血液透析患者、2例结缔组织病患者、1例溶血患者及1例肾移植术后患者，共有81例患者入组，包括男性39例、女性42例，年龄(59.9±13.6)岁，其中13例患者同时患有高血压及糖尿病。81例患者共进行了162次淋巴细胞亚群分析检测，其中42例患者仅进行1次检测，39例患者进行了1次以上检测(包括19例检测2次，9例检测3次，3例检测4次，5例检测5次，3例检测6次)。

2.1 不同临床亚型首次淋巴细胞亚群检测比较

81例患者检测距发病时间为(33.9±10.4) d，检测时的疾病分型为：普通型35例、重型39例、危重型7例。普通型患者年龄低于重型患者[58(44，63)岁vs. 68(58，73)岁，P=0.001]，普通型与危重型、重型与危重型患者间年龄差异无统计学意义(P>0.05，表1)。检测距发病时间3组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 不同临床亚型组间血常规及淋巴细胞亚群差异

比较不同临床亚型组间血常规及淋巴细胞亚群各指标间差异，结果显示白细胞计数、中性粒细胞和淋巴细胞百分数及绝对数、T淋巴细胞、B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及NK细胞绝对数在3组间差异均有统计学意义(P<0.05，表2)，所有指标的Jonckheere-Terpstra检验均存在变化趋势，白细胞计数、中性粒细胞百分比及绝对数等指标随病情危重进行性增高，其余指标均随病情危重程度加重而呈递减趋势。CD4+/CD8+在不同组间差异没有统计学意义(P>0.05)。

表2 不同临床亚型患者血常规及淋巴细胞亚群分析Table 2 Analysis of routine blood test and lymphocyte subsets in patients with different clinical classifications

2.3 首次检测时淋巴细胞亚群计数处于正常及异常参考值范围患者比较

81例患者中有22例在首次检测时，淋巴细胞亚群中T淋巴细胞、B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及NK细胞绝对数、CD4+/CD8+六项指标均在正常参考值范围内(正常组)，其余59例此六项指标存在一项或多项异常(异常组)。统计分析表明，正常组年龄低于异常组[(52.3±13.3)岁vs. (62.7±12.6)岁,P=0.002，表3]。异常组有6例死亡，但与正常组相比差异无统计学意义。在性别、临床亚型、检测距发病时间等基本特征上，两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 首次检测淋巴细胞亚群正常组及异常组基本资料Table 3 Basic information for the first test of lymphocyte subsets in the normal and abnormal groups

进一步对22例正常组患者进行分析，男12例、女10例，年龄(52.3±13.3)岁，检测距发病时间为(35.1±9.7) d。检测时疾病分型：普通型12例、重型10例。普通型及重型两组患者在性别、年龄、检测距发病时间等基本特征方面差异均无统计学意义(P>0.05，表4)。22例患者中有15例同时进行了COVID-19病毒抗体检测，其中12例IgM、IgG双阳，2例IgG单阳，1例双阴；追溯其既往核酸检测结果均为阳性，为确诊患者。有6例患者进行后续多次淋巴细胞检测，最终结局均为好转出院，其中仅2例患者在后续检测时上述六项指标正常，其余4例均出现NK细胞绝对计数下降，包括1例伴有T淋巴细胞绝对数、CD4+T淋巴细胞绝对数、CD8+T淋巴细胞绝对数的减低。

表4 首次检测时淋巴细胞亚群计数处于正常范围患者基本资料Table 4 Basic information on patients with lymphocyte subsets counts in the normal range at the first test

59例异常组患者中，半数以上存在NK细胞、CD8+T淋巴细胞绝对数低于正常参考值范围，约1/3患者CD4+/CD8+高于正常参考值范围(表5)。将NK细胞、CD8+T淋巴细胞绝对数均低于正常参考值范围的患者作为一组，其余指标异常患者作为一组，比较两组间差异发现，NK细胞、CD8+T淋巴细胞绝对数均低于正常参考值范围组危重型患者多于其余指标异常组患者，两组普通型、重型、危重型患者比例分别为4 ∶8 ∶7和19 ∶21 ∶0(P=0.001，表6)，且死亡病例均在此组(6例vs. 0例，P=0.001)， 年龄、性别及检测距发病时间等基本特征在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

表5 淋巴细胞亚群异常情况(n=59)Table 5 Abnormalities in lymphocyte subsets (n=59) n(%)

表6 NK细胞、CD8+ T淋巴细胞低于正常参考值范围组与其他指标异常组患者比较Table 6 Basic information of NK & CD8+ T cell both decrease group and other abnormal groups

2.4 B淋巴细胞在不同临床亚型组间差异

81例患者中仅15例患者淋巴细胞亚群存在B淋巴细胞绝对数低于正常参考值范围，2例高于正常参考值范围，64例均在正常参考值范围内。减低组与正常组普通型、重型、危重型比例分别为4 ∶7 ∶4 和 30 ∶31 ∶3，减低组危重型患者比例多于正常组，两组间差异有统计学意义(P=0.043，表7)，两组在性别、年龄、检测距发病时间、IgM及IgG抗体滴度等方面差异均无统计学意义(P>0.05，表8)。仅部分患者在检测淋巴细胞亚群一周内进行了抗体检测，减低组与正常组分别为5例和33例。

表7 B淋巴细胞计数减低组与正常组比较Table 7 Comparison of B-lymphocyte decrease with normal group

表8 检测抗体患者B淋巴细胞计数减低组与正常组比较Table 8 Comparison of B-lymphocyte decrease with normal group who underwent antibody testing

3 讨论

新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140 nm。其基因特征与重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)有明显区别，目前研究显示，与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85%以上[3]，发病早期外周血白细胞总数正常或减少，可见淋巴细胞计数减少[4]，成人重型、危重型临床预警指标包括外周血淋巴细胞进行性下降[5]。

淋巴细胞及其亚群在维持免疫系统功能方面起着重要作用。病毒感染后，不同病毒类型引起淋巴细胞总数及亚群的改变各不相同，说明淋巴细胞亚群的改变与病毒的致病机制有潜在的联系。因此，明确SARS-CoV-2感染后淋巴细胞亚群的特征非常重要，可以为探索免疫机制提供新的见解。

本研究重点关注不同临床亚型患者淋巴细胞亚群间存在的差异，结果显示淋巴细胞中，T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞这三个主要亚群的绝对计数，在危重型患者较普通型及重型患者都明显减少，且随疾病危重程度增加有进行性下降趋势。说明SARS-CoV-2感染对机体固有免疫及获得性免疫、细胞及体液免疫均存在显著影响，且与疾病危重程度相关。

SARS-CoV-2感染会影响患者的固有免疫系统。NK细胞是机体发挥固有免疫的重要细胞，无需抗原的预先刺激和活化，即可直接杀伤被病毒感染的自身细胞。本研究显示，危重型患者NK细胞计数更低，随疾病严重程度，NK细胞计数呈进行性减低趋势。81例患者中有59例存在主要淋巴细胞亚群一项或多项异常，其中最多的异常项为NK细胞计数低于正常参考值范围，说明SARS-CoV-2影响机体固有免疫功能。NK细胞的减少是由于清除SARS-CoV-2导致的消耗性减少且未恢复，还是由于SARS-CoV-2抑制了NK细胞的功能及生成，还需进一步进行基础实验，进行NK细胞功能检测以验证。但从22例首次检测指标均正常的患者后续仍出现NK细胞计数间断下降来看，SARS-CoV-2可能是影响了机体的固有免疫，后续的NK细胞间断下降是否意味着机体还有活动性病毒存在，是否可结合核酸检测和病毒分离以更好地解释所谓SARS-CoV-2“复阳问题”，仍有待进一步研究解答。有文献报道使用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)/离子霉素(ionomycin，Ion)刺激后，NK细胞功能在重症及非危重症患者间差异未见统计学意义[2]，猜测SARS-CoV-2对NK细胞的影响仅限于数量。NK细胞计数随疾病严重程度减低的改变与在SRAS中观测到的结果相同[6-8]，结合SARS患者淋巴结病理组织中NK细胞数量减少，考虑NK细胞的防御功能被破坏[9]，但也有动物模型研究认为SARS-CoV清除并不需要NK细胞参与[10]。SARS-CoV-2对NK细胞存在明显影响，但其具体机制仍有待探讨。

SARS-CoV-2影响患者细胞免疫。T淋巴细胞参与机体细胞免疫功能，可进一步分为CD4+、CD8+T淋巴细胞两个亚群，分别起到杀伤及辅助杀伤功能。本研究显示，危重型患者T淋巴细胞计数更低，随疾病严重程度增加，T淋巴细胞计数呈进行性减低趋势，CD4+、CD8+T淋巴细胞两个亚群变化趋势同T淋巴细胞计数。而存在上述指标异常的患者中，约56%出现CD8+T淋巴细胞计数低于正常参考值范围，约58%患者CD4+T淋巴细胞在正常参考值范围内，近1/3患者CD4+/CD8+高于正常参考值范围，可见T细胞两个亚群虽然都随T淋巴细胞一样呈减低趋势，但以CD8+T淋巴细胞减低更明显且常见。前期文献亦观察到T淋巴细胞亚群在危重症组及非危重症组间存在差异，但危重症组CD4+T淋巴细胞比CD8+T淋巴细胞下降更明显[2]。考虑结果不同的原因可能与样本量及临床分型存在差异有关，可扩大数据规模予以验证。SARS期间人们也较多关注了T淋巴细胞亚群，在SARS患者肺间质中，CD8+T细胞约占总浸润性炎症细胞的80%，在清除感染细胞中的SARS-CoV和诱导免疫损伤中发挥重要作用[11]。CD4+T细胞的耗损与肺内淋巴细胞的募集、中和抗体和细胞因子产生的减少有关，导致强烈的免疫反应并导致间质性肺炎，使得SARS-CoV在肺内的清除延迟[12]。两群细胞在COVID-19中的作用机制仍有待进一步基础实验证实。

SARS-CoV-2对患者体液免疫的影响尚不明确。B淋巴细胞是发挥体液免疫的主要细胞，危重型患者B淋巴细胞计数低于重型及普通型患者，与文献报道一致[13]，但也有文献报道认为不同临床亚型患者B淋巴细胞计数差异无统计学意义[2]。体液免疫的主要功能就是产生抗体，以利于病原体清除并获得长久免疫。为了明确B淋巴细胞减少是否影响抗体产生，本研究比较B淋巴细胞计数减低患者与在正常范围患者的抗体滴度，结果显示差异无统计学意义。检测抗体的时间在两组间亦无差异，则可以排除抗体滴度随时间衰减而导致的检测差异。COVID-19对B淋巴细胞的影响与SARS不同，既往报道认为B淋巴细胞计数与SARS病程相关，重型病例计数低于普通型患者，但未明确表示是否影响抗体产生[6]。

既往文献多单一报道某个淋巴细胞亚群变化情况，很少把不同亚群进行组合比较。本研究发现，较少有患者出现单项淋巴细胞亚群异常，多为多项异常，而选取异常频率最高的两项(NK细胞及CD8+T淋巴细胞)来比较患者的病情及结局发现，NK、CD8+T淋巴细胞计数均减低患者较其他指标异常患者更容易出现危重病例及死亡病例，故猜测可以通过检测NK、CD8+T淋巴细胞计数对患者病情变化进行预测，但鉴于本研究检测时间并未处于疾病初期，利用此时期数据建立预测模型意义较低，且无验证数据库，考虑可在其他地区有疾病初期数据时进行验证，并与淋巴细胞计数进行比较，选取更灵敏的预测指标。

本组中有22例患者在首次检测时T淋巴细胞、B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞绝对数，以及CD4+/ CD8+六项指标均在正常参考值范围内。检测时间为病程的第(35.05±9.71)天，因缺乏疾病初期淋巴细胞亚群分析资料，所以不能明确这部分患者是否存在疾病初期淋巴细胞亚群计数异常。假设既往曾存在异常，就诊时已恢复正常，则患者CD4+、CD8+淋巴细胞亚群恢复时间与SARS大致相同[14]，但NK细胞恢复时间则明显早于SARS患者[6]；假设既往即在正常范围内，那么导致患者出现亚群异常的原因更需要进一步探究。

缺乏疾病早期阶段数据是本研究不可避免的客观因素，也是本研究的不足之处，因为本组患者在疾病早期阶段，按早期诊疗规范多处于居家隔离或方舱医院隔离阶段，未能进行相关检测，仅疾病进展时才收治入危重症病房；另外，淋巴细胞亚群相关指标检测也是疫情中后期阶段才开展的检测项目。

综上，本研究通过比较不同临床亚型患者淋巴细胞亚群间差异，发现SARS-CoV-2对患者固有免疫系统及获得性免疫系统均存在明显影响，且与疾病危重程度相关。本研究对观测到的数据进行多角度展示，为深入探讨SARS-CoV-2感染与机体免疫功能变化的机制提供了临床观测数据。