内质网应激的信号通路及其与肝脏疾病的关系

李 姚， 王志鑫， 温 浩， 王海久， 才让东智， 于文昊， 张 丽， 樊海宁

1 青海大学研究生院， 西宁 810000； 2 青海大学附属医院 肝胆胰外科， 西宁 810000；3 青海省包虫病研究重点实验室， 西宁 810000； 4 新疆医科大学第一附属医院， 乌鲁木齐 830001

1 内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)及相关通路

1.1 生物学特性 内质网是哺乳动物一种重要的细胞器，其膜结构占细胞内膜的1/2，在内膜系统中也占有重要中心地位。ERS一方面是为了激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)以抵制应激诱因造成的有害影响，另一方面UPR不足时可以重建内质网稳态，UPR信号通路是通过细胞凋亡途径而引起细胞损伤甚至死亡[1]。各种损伤因素作用于内质网，引起蛋白质加工/运输障碍或摄取/释放Ca2+障碍，导致内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及细胞内Ca2+平衡紊乱，进而激活UPR。UPR可通过某些特定基因的转录而增强蛋白质折叠的能力，保持内质网稳态，维持细胞正常功能[2],当稳态不能重建时，UPR信号转导途径将引发细胞凋亡。内质网膜上存在3种感受腔内未折叠蛋白堆积的感受器蛋白：蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、肌醇需求酶1(IRE-1)、活化转录因子6(ATF6)[3]。

1.2 ERS的3种信号转导通路

1.2.1 PERK通路 PERK是位于内质网中的一种Ⅰ型跨膜蛋白，是真核起始因子2α (eIF2α)激酶家族成员之一。在正常情况下，PERK作为单体存在，处于非活性状态，与内质网伴侣蛋白GRP78/BiP结合。ERS发生时，BiP与PERK解离[4]，PERK通过低聚和反式自磷酸化激活。激活磷酸化eTF2α，导致平动衰减。磷酸化eIF2α翻译激活活化的转录因子4(ATF4)mRNA和ATF且诱发UPR目标基因的表达，参与氨基酸代谢、抗氧化反应、ERS诱导凋亡[3,5]。其中ATF4是环磷酸腺苷反应元件结合转录因子(CREB)家族成员，能结合ATF/CRE元件序列5′-TGACGTCA-3′和氨基酸反应元件的核心序列5′-ATTGCATCA-3′，可进一步调控GRP78、GRP94、GADD34、CHOP、ATF3、P58IPK、EDEM及PDI等的表达[6-7]。并且产生的GADD34可与丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的抑制剂形成复合物，促进eIF2α去磷酸化，恢复蛋白质合成，从而形成负反馈调节环[7]。

1.2.2 IRE-1通路 IRE-1是一种具有RNase结构域的Ⅰ型跨膜蛋白，带有丝-苏氨酸激酶和核酸内切酶的活性， 包括IRE-1α和IRE-1β两种亚型。在正常情况下，IRE-1通过与BiP结合而作为单体存在。在ERS下，BiP与IRE-1解离，IRE-1通过低聚和反应自磷酸化被激活。激活的IRE-1启动其RNase活性，催化非常规剪接X盒结合蛋白1(X-box-binding protein-1，XBP1)mRNA，合成剪接的活性转录因子[8], XBP1属于CREB/活化转录因子家族成员。 XBP1诱导参与内质网相关性降解(endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD)和脂质合成的UPR靶基因表达以及内质网伴侣蛋白的表达[3,9]。相关研究发现 IRE-1α或 XBPl 敲除的细胞会表现出ERAD方面的功能缺失，说明IRE-1α/XBP1信号通路与ERAD功能有关。

1.2.3 ATF6通路 ATF6是内质网的一种Ⅱ型跨膜蛋白，是一种碱性亮氨酸拉链转录因子[10]。ATF6包含内质网腔内、跨膜区和胞质3个结构域，其N端驻留于胞质中，有一个bZIP的DNA转录激活域；C端驻留于内质网腔内，能够感应内质网膜中未折叠蛋白聚集传来的信号[11]。在正常情况下，由于ATF6的高尔基定位信号被BiP覆盖，抑制了ATF6向高尔基体的易位。在内质网胁迫下，ATF6从BiP中释放并转移到高尔基体。在高尔基体中，ATF6被位点1蛋白酶和位点2蛋白酶裂解[12]，然后ATF6的功能片段被释放到胞质中[13]。这个片段转移到细胞核，诱导内质网伴侣蛋白、ERAD和 XBP1的表达。

2 ERS与乙型肝炎

乙型肝炎是由HBV感染引起的肝脏炎性状态，常是肝细胞癌(HCC)的发病机制[14]。虽然已有许多关于HBV在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝炎、肝硬化、HCC等发病机制中的报道，但其机制尚未完全了解。到目前为止，有关ERS介导HBV突变的综述仅限于一种特定的突变型: preS2缺失。

许多研究认为preS突变体(LHBs和MHBs)在肝脏疾病中的作用机制与ERS明显相关。preS1和preS2突变体都有分泌表面蛋白的缺陷，这种突变体在内质网中积累导致磨玻璃肝细胞的形成，这是慢性乙型肝炎感染的组织学标志。Pollicino等[15]筛选了40例未经治疗的慢性乙型肝炎患者，其中有14例(35%)患者表现出单一或多个preS/S突变。他们发现preS/S突变体和分泌HBsAg水平呈负相关。在最近的一项研究中，Montalbano等[16]证实了被ERS信号激活转染的肝细胞(Huh7和HepG2细胞)含有包含HBV的突变包膜蛋白(pSVL质粒在preS1中发生突变，pSVM质粒在preS2中发生突变)。免疫荧光显微镜显示LHBs在两种细胞系中均定位于内质网，仅有部分MHBs共定位于内质网腔；该研究还表明，LHBs和HBsAg的比例对于HBsAg和病毒粒子的分泌是必要条件之一。在这方面，Ou等[17]也发现过表达含有preS1的LHBs阻碍了HBsAg的分泌。Bock等[18]检测了3种preS区域的自然突变:MUT1(CCAAT box中的一个点突变)、MUT2 (CCAAT盒中的一个6 bp缺失)和MUT3 (preS2区域中的一个153 bp缺失)。他们在内质网中发现了突变S蛋白的积累。此外，Ou等[17]报道了pSVL和pSVM质粒提高了GRP78和CHOP在Huh7细胞系中的表达，IRE-1α和ATF4水平没有发生显著变化，免疫荧光数据同样显示GRP78增加。此外，Huh7在转染pSVM的细胞时GRP78的表达水平增加了2.0倍，pSVL组表达水平无明显变化。与阳性对照细胞和TG-treated细胞相比，pSVM和pSML转染的Huh7细胞显示XBP1被激活。不仅IRE-1α/XBP1被激活，而且PERK也被pSVL和pSVM激活，PERK和eIF2α的磷酸化高度增加。这些数据表明突变的HBV包膜蛋白激活了肝细胞ERS通路。在HBV感染者中，ERS介导乙型肝炎可以归纳为3个方面:(1)内质网中存在preS1和preS2突变体并诱导ERS，同时诱导ERS伴侣GRP78升高起到保护作用；(2) preS突变会影响S基因的调节，导致乙型肝炎的发生；(3)HBV基因组突变可产生多种HBV编码蛋白的突变类型，这些突变主要通过增加突变蛋白的积累来增强受感染肝细胞的ERS。总体而言，了解HBV如何诱导内质网损伤及其机制将为慢性乙型肝炎患者提供新的治疗选择。

3 ERS与肝衰竭

肝衰竭包括急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、慢加急性(亚急性)肝衰竭和慢性肝衰竭。肝衰竭为当今国内外研究的难点，其发病机制仍未完全明确。张向颖等[19]应用D-氨基半乳糖( D-GalN )和脂多糖(LPS)诱导大鼠肝衰竭模型，对照组同步注射等体积的生理盐水进行比较。通过采用免疫组化及RT-PCR方法检测两组肝组织Caspase-12、IRE-1、NF-κB、NF-κB诱导的激酶(NIK)表达情况，采用常规HE染色、流式细胞技术观察肝细胞凋亡情况,分析内质网跨膜蛋白IRE-1与肝细胞凋亡程度、Caspase-12的相互关系及Caspase-12与肝细胞凋亡程度的相互关系，结果表明随着肝脏病理损伤的加重肝组织中IRE-1α、Caspase-12表达增加,IRE-1α与Caspase-12、细胞凋亡率以及Caspase-12与细胞凋亡率均呈明显正相关, IRE-1α/ TRAF2/ Caspase-12介导的信号转导通路是ERS导致暴发性肝衰竭中肝细胞凋亡的重要机制之一。在暴发性肝衰竭中,随着肝脏病理损伤的加重肝组织中NF-κB表达增加,且与肝细胞凋亡率呈明显正相关,从细胞、蛋白、基因水平证实NF-κB在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中起重要作用。并且证明了肝衰竭肝组织中NF-κB p65与IRE-1α呈明显正相关,但与NIK之间无相关性。提示NF-κB可能在ERS信号转导通路中起重要作用,但在IRE-1α/TRAF2/NF-κB这一信号转导通路中,连接TRAF2与NF-κB的信号转录分子NIK对NF-κB p65无明确调控作用。

最近有研究[20]发现在四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝衰竭模型中，肝脏 NF-κB p65 易位和eIF2α磷酸化显著增加，ERS抑制剂4-基丁酸干预后可以明显抑制小鼠肝损伤。在 N-乙酰氨基酚(APAP) 诱导的药物性肝衰竭中，APAP能够诱导ERS肝损伤和肝细胞死亡，ERS特异性凋亡基因CHOP敲除小鼠进行胆管结扎，肝脏炎症反应激活，4-基丁酸抑制ERS显著改善 APAP诱导的小鼠肝损伤。CCl4诱导的药物性急性肝衰竭小鼠模型中，ATF4 减少促进急性肝损伤。在慢性乙型肝炎重症化引发的慢加急性肝衰竭中，ERS诱导保护性的UPR在慢性乙型肝炎中被激活，而在肝衰竭期间则失活，但是严重ERS诱导的相关凋亡蛋白随着肝衰竭发生而逐渐高表达；动物实验[21]表明，ERS在 D-GalN / LPS 诱导的急性肝衰竭动物模型中被引发，4-苯基丁酸抑制ERS可以显著抑制炎症反应并减轻急性肝衰竭肝损伤，细胞实验表明，ERS协同 LPS 激活 Toll样受体4，诱导促炎因子的大量产生。综上所述，在肝衰竭患者中，ERS相关伴侣蛋白的表达增加与ERS参与暴发性肝衰竭肝细胞凋亡的发生发展有关。ERS在肝损伤方面起到保护作用，抑制ERS可以调节炎症反应，降低肝损伤发生率。ERS是肝衰竭参与机制之一，有利于研究出更多治疗肝衰竭的方法。

4 ERS与HCC

ERS促进肿瘤细胞逃避免疫监测，潜在的具体机制仍然未知[22]。Liu等[23]研究证明ERS诱导HCC细胞释放外泌体，外泌体通过调节程序性死亡配体1(PD-L1)的表达来减弱抗肿瘤免疫。ERS的标志物GRP78、ATF6、TRE-1α在HCC组织中表达上调并与HCC患者的总生存期和AFP临床评分呈负相关。ERS相关蛋白表达与HCC组织CD68+巨噬细胞募集及巨噬细胞PD-L1表达呈正相关。定量PCR分析经衣霉素处理的HCC细胞中miRNA-23a-3p(外泌体中最丰富的miRNA之一)，其水平与总生存率呈负相关。外泌体衣霉素处理组可上调巨噬细胞中PD-L1的体内外表达。生物信息学分析表明，miRNA-23a-3p通过磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)-磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶(PI3K/PKB)通路调控PD-L1表达。体外转染和共培养实验显示miRNA-23a-3p抑制了巨噬细胞中PTEN的表达。Huang等[24]研究发现姜黄素可诱导人癌细胞中ATF6、ATF4和CHOP等表达增高，引起细胞凋亡。日柏醇可诱导人癌细胞中UPR信号通路相关基因表达，促使细胞发生凋亡[25]。HCC细胞HepG2在衣霉素诱导下发生应激反应且细胞凋亡增多，进一步说明了ERS在诱导HCC细胞凋亡中的作用。Jin等[26]研究发现，小鼠给予六价铬喂养后，取肝组织检测显示GRP78、ATF6和CHOP不仅与索拉非尼在HCC治疗中产生耐药有关，还影响着抗肿瘤药物对HCC的治疗效果[27]。Guo等[28]报道，ERS中CHOP途径在山奈酚诱导的HCC细胞凋亡中发挥重要作用，抑制剂的作用下HCC细胞可免受ERS诱导的细胞凋亡。总结ERS在HCC中产生的机制：(1)ERS诱导HCC细胞释放外泌体，外泌体通过调节巨噬细胞PD-L1的表达来减弱抗肿瘤免疫；(2)ERS在HCC细胞中释放外泌体，上调巨噬细胞中PD-L1的表达，进而通过miRNA-23a-PTEN-AKT外泌体途径抑制T淋巴细胞功能。(3)HCC可通过激活UPR来顺应各种不利环境，促进HCC适应缺氧环境，有利于肿瘤细胞的存活。因此，ERS的发生及其诱导HCC细胞凋亡机制有可能为研究新的抗肝癌靶点提供新思路。

5 ERS与肝棘球蚴病

肝包虫病是牧区较常见的寄生虫病，亦称肝棘球蚴病，此病仍然是一个公共卫生问题，分布于世界范围内。阿苯达唑是目前唯一用于包虫病术前术后的口服药物。然而，由于其疗效低、并发症多，找到新的治疗药物成为世界级挑战[29]。Nicolao等[30]发现硼替佐米(bortezomib，BTZ)分别在5 μmol/L和0.1 μmol/L浓度下对囊型包虫病小鼠的原头节和后绦幼虫存在影响，结果显示在小鼠接触药物96 h后杀死了50%的幼虫;使用BTZ 8 d后原头蚴死亡率为100%，其半抑制浓度(IC50)为(14±3)μmol/L。BTZ目前作为一种用于骨髓瘤化疗的蛋白酶体抑制剂，研究表明在0.6 μmol/L的半最大效应浓度(EC50)剂量下对多房棘球蚴虫具有高水平的杀伤作用。BTZ处理的多房棘球蚴会导致泛素化蛋白的积累和寄生虫死亡[31]。寄生虫细胞内结构的蛋白酶体可能是靶点，因为其参与细胞分化、增殖、包囊形成、幼虫侵袭的调控。抑制蛋白酶体干扰内质网的稳态，影响蛋白质的折叠，并通过转录诱导ERS相关标志物的表达。在真核生物进化过程中，UPR传感器增加时只有IRE-1/XBP1在酵母菌中发出信号。在秀丽隐杆线虫和黑腹线虫中，有3个分支在它们的基因组中编码，但只有2个是功能性的(IRE-1/XBP1和PEK1)，而在哺乳动物中IRE-1、PERK和ATF6通路均可在ERS中调节稳态[32-33]。特别是缺乏内质网传感器IRE-1/XBP1和ATF6的细胞内寄生虫，如利什曼原虫、弓形虫和锥虫等，同样通过PERK识别错误折叠的蛋白进行UPR。Mori[34]通过对棘球绦虫基因组的生物信息学和转录组分析，发现棘球蚴可能具有所有这些功能蛋白。Nicolao等[30]通过RT-PCR和real-time PCR也展示了UPR信号IRE-2和XBP1基因在细粒棘球绦虫原节段中的表达并观察到BTZ治疗后的上调，证明了BTZ对寄生虫的有害作用，UPR的激活加剧了寄生虫的死亡；研究还表明，在正常生长条件下，Eg-GRP78和Eg-calnexin基因在两种幼虫形态中均表现出较高的基础表达水平，而在BTZ处理后的原头蚴中仅表现出显著的基因上调，证实了ERS和UPR的激活。令人惊奇的是，在蛋白质合成速率超过原节段的元荚体细胞，Eg-GRP78等伴侣蛋白在BTZ反应下的表达增加并不明显。因此，在这种幼虫形态中，伴侣蛋白和UPR转导蛋白的低表达可以解释BTZ在低浓度下的高敏感性。ERS与肝包虫病研究内容仍然缺乏，上述只能证明内质网伴侣蛋白和UPR转导蛋白mRNA的增加以及BTZ诱导细粒棘球绦虫产生ERS和自噬。希望在不久的将来，ERS机制及其药理调控途径能成为治疗肝包虫病的新思路。

6 小结

综上所述，ERS过程复杂，其在肝脏疾病中扮演着重要角色。ERS可以保护细胞，避免未折叠蛋白过多而使肝组织发生病理损伤。如UPR可通过某些特定基因的转录而增强蛋白质折叠的能力，保持内质网稳态，维持细胞的正常功能。当UPR不足时，外源性刺激则会导致肝细胞的损伤。目前，ERS的许多方面尚不清楚，随着对ERS与肝脏疾病关系的研究逐渐深入，有助于从细胞及分子水平进一步了解肝脏疾病的发生发展机制，为探索肝脏疾病的免疫治疗提供新的策略。