寒热型哮喘大鼠支气管平滑肌钙通道开放概率的差异

陈志斌 ，吴丽娇 ，王春娥 ，陈可强

（1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州350003；2.福建省中医药科学院，福建 福州350003）

支气管哮喘（哮喘）是临床常见的慢性气道炎症性疾病，主要以慢性气道炎症、气道重塑和气道高反应性为特征。 近年来，人们逐渐认识到气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs））在哮喘发病机制中的重要性。 ASMCs 不仅具备增殖能力，还可释放细胞因子、趋化因子、生长因子和血管生成因子［1］。 此外气道高反应通过 ASMCs 介导，与Ca2+浓度相关［2］。 气道平滑肌的收缩依赖于细胞内Ca2+浓度的升高，并且Ca2+参与平滑肌的兴奋耦联过程。 支气管平滑肌细胞（bronchial smooth muscle cells，BSMCs）是 ASMCs 主要组成部分，维持支气管正常的舒张收缩功能。 哮喘在中、西医诊断中均有各自分型，指导着临床治疗，而大量研究及临床实践证明中西医结合治疗疗效显著，因此本课题通过研究哮喘机制方法区分中医哮喘证型差异性，为哮喘治疗提供更精确的诊断依据。 中医哮喘急性期多以寒哮、热哮型为主，而钙通道是气道上细胞重要的离子通道之一，研究中医哮喘证型钙通道开放概率的差异性对临床证型诊断有重要意义。 本实验通过分离培养寒、热型哮喘SD 大鼠模型，采用膜片钳技术细胞贴附式方法检测BSMCs 内钙通道开放概率，研究寒、热型哮喘大鼠BSMCs 钙通道变化，探讨其在寒热型哮喘发病中的意义。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF 级5～6 周龄健康雄性大鼠，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，生产许可证号：SCXK（苏）2017-0001，动物合格证编号：201908685。 饲养于SPF 级动物实验室，恒温恒湿，模拟标准日夜系统（12 h 光照／12 h 黑夜），予以自由饮食及饮水。

1.2 主要试剂 鸡卵清白蛋白（VOA）、脂多糖、木瓜蛋白酶（美国 Sigma 公司，货号：A5503、S0130、P4762）；戊巴比妥钠（上海隆盛化工有限公司，CAS：57-33-0）；PBS 缓冲液（南京生兴生物有限公司，货号：SN331）；I 型胶原酶（北京索莱宝科技有限公司，货号：C8140）；胰酶、牛血清白蛋白（美国 Hyclone 公司，型号：SH30042.01、SH30070.03）；DAB 显色液、小鼠二抗（丹麦 DAKO 公司，货号：K3468、K4001）；苏木素（珠海贝索生物技术有限公司，货号：BA-4097）；氯化钾、氯化钙、氯化镁、氢氧化铝（上海凌峰化学试剂有限公司，货号：7447-40-7、10043-52-4、7786-30-3、21645-51-2、21645-51-2）；多聚甲醛（南京化学试剂股份有限公司，货号：C0671510223）；HEPES 缓冲盐水（上海钦诚生物科技有限公司，货号：QC25-02540）；小鼠一抗（英国 Abcam 公司，货号：ab7817）。

1.3 主要设备 雾化机（广东粤华医疗器械厂有限公司）；DMEM 培养基（美国 Hyclone 公司）；T-25 培养瓶（美国 Corning 公司）；CO2培养箱（美国 Thermo fisher 公司）；荧光倒置显微镜（日本 Nikon 公司）；微电极推制器、BF150-86-10 Sutter 玻璃管（美国Sutter 公司）；膜片钳放大器、数模／模数转换卡、低通滤波器、微型计算机软件（美国Axon 公司）。

2 实验方法

2.1 实验分组及模型建立 参照参考文献［3-5］。将18 只大鼠按数字表法随机分为正常对照组、寒哮组、热哮组，每组各6 只，自由摄食、饮水7 d 后开始造模。 大鼠分别于造模第1 天和第8 天腹腔注射VOA 和氢氧化铝混悬液1 mL（鸡卵清白蛋白100 mg和氢氧化铝干粉100 mg 溶于1 mL 的生理盐水中）致敏诱喘，出现呼吸加快、竖毛、前肢缩抬、点头呼吸等。① 热哮组：第1 天和第8 天采用0.4%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，用移液管取脂多糖稀释液40 μL于双侧鼻孔滴鼻；第15 天开始以1%VOA 溶液超声雾化，每次30 min，每日1 次，连续7 d。以大鼠出现烦躁、汗多、口渴、点头、节律性收腹样喘促等现象，提示造模成功。 ② 寒哮组：第15 天开始，将大鼠放入雾化箱内，以1%VOA 超声雾化激发，每次30 min，每天1 次；同时将大鼠放入寒箱内（0～2℃），每次20 min，每天 1 次，连续 7 d。 将大鼠激发至哮喘发作，出现点头、身体颤抖、节律性收腹样喘促现象等，表明造模成功。 造模成功后，继续雾化激发及寒冷刺激4 周。③ 正常对照组：以生理盐水1 mL 取代卵蛋白生理盐水混悬液进行腹腔注射； 第15 天开始，以生理盐水超声雾化激发。

2.2 支气管平滑肌的分离 腹腔注射大剂量戊巴比妥钠将3 组大鼠处死后，将肺取出，置于含双抗的PBS 缓冲液中漂洗，分离大鼠两侧肺组织中3～4 级支气管，剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的组织块；加入 2 mg／mL 型胶原酶和 2.5 mg／mL 木瓜蛋白酶，置于 37 ℃培养箱中消化90 min，1 000 rpm 离心8 min，去除上清，加入0.125%胰酶37 ℃消化 5 min，加入含血清的DMEM 培养基终止消化，1 000 rpm离心8 min，去除上清，加入含血清的DMEM 培养基重悬细胞，用100 目筛过滤，用DMEM 培养液反复冲洗、离心2 次，即可得到含支气管平滑肌细胞的细胞悬液；将细胞悬液接种至T-25 培养瓶中，放入培养箱中培养；3 d 后，更换培养基，待细胞长至80%～90%融合度时，使用胰酶将细胞消化下来接种至3 个培养瓶中，培养2～3 代的细胞用于实验。

2.3 免疫组化鉴定 将分离的大鼠BSMCs 铺板于培养皿内，制作细胞爬片，培养24 h 后，去除培养液，PBS 缓冲液清洗后加入多聚甲醛固定30 min；吸去多聚甲醛后，PBS 洗3 次后加入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；PBS 洗 3 次，每次 5 min，吸去 PBS 后加 5%牛血清白蛋白（BSA）封闭20 min（封闭电荷）；去除BSA液，每孔加入 100 μL 1∶200 稀释的一抗，4 ℃过夜，PBS 洗 3 次后每孔加 100 μL 的二抗，37 ℃孵育 30 min；PBS 洗 3 次后，每张切片加 50～100 μL 新鲜配制DAB 溶液，显微镜控制显色；显色完全后，蒸馏水洗，苏木素复染，吸去苏木素，水洗，镜下拍照。

2.4 BSMCs 的钙通道开放概率记录 运用膜片钳技术细胞贴附式方法测定不同Ca2+浓度BSMCs 内钙通道开放概率。 调节P-1000 拉制仪参数（RAMP-20），使得BF150-86-10 中空硅玻璃管入水阻值达到8.0～10.0 兆欧；从培养箱中取出细胞，置于BSMCs外液（氯化钠 130 mmol／L、氯化钾 5 mmol／L、氯化钙1 mmol／L、氯化镁 1 mmol／L、HEPES 缓冲盐水 20 mmol／L，pH7.4）；用微电极电阻约为 3 兆欧，单通道电流经膜片钳放大器放大，探头反馈电阻为10 千兆欧，低通滤波器滤波频率为3 kHz。 数据采集与分析：由计算机软件控制产生数字脉冲，经数／模（D／A）转换成模拟脉冲电压信号， 控制细胞的膜电位，电流信号通过0.1 千兆欧探头，经膜片钳放大器的电流电压转换输入到模／数转换卡变成数字信号，再经数据采集系统微型计算机软件，采集程序输入计算机。

2.5 统计学方法 运用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析。 计量资料符合正态分布的以（±s）表示，组间比较采用t 检验；不符合正态分布的采用秩和检验，以［M（P25，P75）］表示。

3 结 果

3.1 3 组钙通道开放概率比较 Ca2+浓度为0.5、1、3、10 μmol／L 时，3 组钙通道开放概率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 Ca2+浓度为 100 μmol／L 时，热哮组和寒哮组钙通道开放概率均较正常对照组升高（P 均＜0.01），热哮组钙通道开放概率较寒哮组升高更明显（P＜0.01）。 见表1。

表1 3 组钙通道开放概率比较［（±s）／M（P25，P75）］

表1 3 组钙通道开放概率比较［（±s）／M（P25，P75）］

注：与正常对照组比较，1） P＜0.01；与寒哮组比较，2） P＜0.01。

组别正常对照组寒 哮 组热 哮 组n 6 6 6 0.5 μmol／L 0.12±0.34 0.12±0.27 0.13±0.02 1 μmol／L 0.12±0.53 0.15±0.01 0.12±0.02 Ca2+浓度3 μmol／L 0.17±0.04 0.18±0.37 0.21±0.40 10 μmol／L 0.35（0.23，0.52）0.46（0.36，0.46）0.42（0.37，0.43）100 μmol／L 0.45（0.42，0.55）0.58（0.56，0.61）1）0.68（0.61，0.70）1）2）

4 讨 论

ASMCs 参与哮喘气道炎症、气道重塑及气道高反应性的发生与发展过程。 目前，对于哮喘研究大多集中于整个气道，而针对BSMCs 的研究较少涉及。钙通道是引起气道平滑肌收缩的主要通道［6］，游离钙是细胞内第二信使，细胞的存活及其功能的维持依赖于细胞内Ca2+的精密调节，细胞内Ca2+浓度升高对ASMCs 起维持和收缩作用。 钙通道开放增加，使细胞内Ca2+浓度升高，引起气道平滑肌收缩［7］，而气道平滑肌的收缩增强被认为可能是哮喘发生气道高反应的重要原因，临床上应用支气管扩张剂可改善哮喘发作引起气道挛急、呼吸困难等症状，进一步说明了气道高反应与ASMCs 收缩有关。哮喘患者ASMCs 钙通道开放增加，细胞内Ca2+浓度增加可使得哮喘患者气道的ASMCs 处于无收缩的活性增加状态，从而导致气道高反应性，此时轻微的刺激即可诱发气道的痉挛［8］。 祖国医学将哮病急性发作期分为热哮、寒哮两个证型［9］，寒哮治以宣肺散寒、化痰平喘为主，热哮治以清热宣肺、化痰定喘为主，二者的治法存在明显区别。 同为哮喘病，中医分型治法却明显不同，寒哮、热哮是否为哮喘病的2 个亚型？ 在不同钙浓度分布下钙通道开放概率两者是否存在差异性？ 因此，本试验运用膜片钳技术细胞贴附式方法检测寒、热型哮喘SD 大鼠BSMCs 内钙通道开放概率的变化，探讨寒哮、热哮之间的差异。

本研究结果表明：随着Ca2+浓度的增加，寒、热型哮喘大鼠钙通道开放概率也不断地增加，热哮组、寒哮组较正常对照组钙通道开放概率增加明显，说明钙通道开放概率的变化可作为哮喘的分型指标。当 Ca2+浓度为 100 μmol／L 时，寒、热型哮喘大鼠的钙通道开放概率增加程度较正常对照组明显，且热哮组钙通道开放概率较寒哮组明显增加，说明寒、热型哮喘大鼠在不同钙浓度下钙通道开放概率有本质上的差异。 因此，钙通道开放概率明显增加，临床应考虑热哮的可能，钙通道开放概率轻度增加时，临床上应考虑寒哮的可能。 今后，我们将进一步深入研究，探讨钙通道开放概率对寒、热哮诊断的具体折点，以期通过对钙通道开放概率的测定，作为寒热哮的诊断指标。