基于DFT方法研究甘草中黄酮类化合物的抗氧化活性

刘靖丽 权彦 闫浩

摘      要：基于密度泛函（DFT）方法研究甘草中黄酮类化合物的抗氧化活性，对甘草素、甘草苷、异甘草素和异甘草苷4种化合物的分子结构及其相应的自由基进行了理论计算。分别在气相和溶剂中获得了4种化合物及其相应自由基的最优几何结构、NBO电荷、BDE和IP等量子化学参数。计算结果显示：4种化合物的抗氧化活性由大到小的顺序为异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷，与实验活性顺序一致，并且4种化合物中C7位是自由基反应的最大可能活性位点。

关  键  词：甘草;黄酮类化合物;抗氧化活性;密度泛函理论

中图分类号：O641       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）10-2163-05

Abstract： In order to study the relationship between the structure and antioxidant activity of flavonoids from licorice， the density functional theory （DFT） B3LYP method with 6-31+G** basis sets was used to optimize the structures of liquiritigenin， liquiritin， isoliquiritigenin， isoliquiritoside and the corresponding free radicals. The properties of the stable geometries were discussed on basis of the molecular geometries， the natural bond order （NBO） charges， the bond dissociation enthalpies （BDE）， ionization potential （IP） and the frontier molecular orbitals theory. The results revealed that the sequence of antioxidant activity of these four flavonoid compounds was： isoliquiritigenin> isoliquiritoside>liquiritigenin>liquiritin， which was consistent with the experimental conclusions. The calculated BDE values for flavonoid compounds clearly demonstrated that the site of C7—OH was the most active site.

Key words： Licorice; Flavonoid compound; Antioxidation activity; DFT

甘草为豆科植物甘草（Glvcyrrhiza uralensis Fisch.）的根及根状茎，属多年生草本植物，是一种补益中草药，具有补脾益气，祛痰止咳，清热解毒，调和诸药等功效[1]。近年来，相关学者对甘草进行了大量的系统研究，其主要的化学成分为黄酮类、三萜皂苷类、香豆素类、生物碱及多糖等，这些物质具有广泛的药理活性[2]。

通过对甘草黄酮类成分的药理研究发现，甘草中黄酮类成分具有抗氧化、抗溃疡、抗肿瘤、抗HIV等作用[3-4]，因而具有潜在的药用开发价值。医学研究表明[5]，活性氧自由基与一些疾病（如衰老、心血管疾病、炎症、肿瘤等）的发生有关，因而开发天然抗氧化剂对预防这些疾病发挥着至关重要的作用。傅乃武等[6]研究了甘草黄酮类成分对活性氧的清除作用，实验表明甘草黃酮类化合物具有显著的抗氧化活性。随后崔誉蓉[7]等测定了甘草中的4种黄酮类成分甘草素、异甘草素、甘草苷和异甘草苷（分子结构见图1）的体外抗氧化活性，并初步探讨了4种化合物的结构与抗氧化活性的关系。结果表明，4种化合物的抗氧化活性顺序为异甘草素、异甘草苷、甘草素和甘草苷。课题组前期合成了异甘草素，研究了其体外抗氧化活性[8]。潘燕[9]等发现甘草水溶性总黄酮具有抗心肌缺血的活性，其机理是水溶性总黄酮可通过抑制自由基的生成，从而减少自由基对人体的危害，保护心肌受损。LEE[10]等通过实验发现甘草的甲醇提取物可保护细胞，免受氧化伤害，因而具有抗氧化的能力。AMAROWICZ[11]等通过体外抗氧化实验发现，甘草的乙醇提取物对DPPH·和HO·自由基有清除作用，但是不同溶剂提取物对化合物抗氧化活性的影响未知。

随着计算化学的发展，密度泛函（DFT）方法被用来研究分子的抗氧活性。WRIGHT等最先采用DFT方法计算了多酚类抗氧化剂的量子化学参数酚羟基解离能（BDE）和绝热电离势（IP）[12]。本课题组前期运用密度泛函理论方法研究了灯盏花乙素及其苷元[13]和黄芪中黄酮类化合物的抗氧化活  性[14]，同时模拟了溶剂对抗氧化活性的影响。虽然张鑫[15]等采用DFT方法研究了甘草素、异甘草素、甘草苷和异甘草苷的抗氧化活性，通过量子化学参数初步分析和比较了4个化合物的抗氧化活性大小，但是他们只考虑了抽氢反应机理，而没有考虑电子转移机理，也没有考虑溶剂效应对化合物抗氧化机理的影响。而在中草药有效成分黄酮的提取和分离过程中，甲醇和乙醇是常用的溶剂，可能会对有效成分的活性产生影响，进而影响抗氧剂的抗氧化机理。为此，本文选取甘草中的4种黄酮类化合物甘草素、异甘草素、甘草苷和异甘草苷为研究对象，比较直接的抽氢反应机理和电子转移机理，同时考虑溶剂效应对抗氧化活性的影响，从原子水平的角度深入揭示4种甘草黄酮类化合物的结构与抗氧化活性关系，以期对中药甘草的开发利用和生物活性研究提供理论上的帮助。

1  计算方法

采用DFT（B3LYP）方法以6-31+G**为基组对4种黄酮类化合物及其自由基的分子结构进行全優化，对于闭壳层的分子选用限制性的计算，而开壳层的自由基用非限制性的计算。分子的几何平衡构型通过频率计算进行验证，没有虚频，说明得到的是能量极小值。最后对化合物及其相应的脱氢自由基和阳离子自由基进行热力学和NBO电荷计算，基于4种化合物酚羟基的O—H键长、NBO电荷、键解离能（BDE）、电离势值（IP）和前线分子轨道等量子化学参数，分析4种甘草黄酮类化合物的抗氧化活性和结构之间的关系及规律。为了评估溶剂对化合物抗氧化活性的影响，以甲醇、乙醇和水为溶剂，采用PCM模型[16]对化合物及其自由基在水溶液中的结构、频率和NBO进行了计算。所有计算均由Gaussian 16软件包完成[17]。

2  结果与讨论

2.1  酚羟基的键长

对于黄酮类化合物来说，它们是通过断裂    O—H键而起抗氧化作用的，故而根据分子中O—H的数目和键长可以初步推断其抗氧化活性的强弱。通过对4种化合物的结构进行分析，发现异甘草素有3个酚羟基，异甘草苷和甘草素有2个酚羟基，而甘草苷只有1个酚羟基。根据化合物所具有的酚羟基的数目，推测异甘草素的清除自由基活性最强，甘草苷的自由基清除活性最弱。根据酚羟基键长分析，计算结果列于表1。

根据分子价键理论：分子的键长越短，键能越大，键越不容易断裂，化学反应也越不活泼，抗氧化活性也越低;反之，键长越长，抗氧化活性越强。因此通过键长大小可以对反应活性做初步的判断。由表1键长数据分析，对于甘草素来说，C7位酚羟基键长大于C4′位酚羟基的键长，可知C7位可能是最大活性位点。而甘草苷则是在甘草素的C4′位发生了糖基化，只有一个C7位的酚羟基。对于异甘草素来说，酚羟基的键长由小到大顺序为： 9—OH、  4'—OH 、7—OH，预测C7位是可能的最大活性位点，更容易清除自由基。而异甘草苷是在异甘草素的C4′位发生了糖基化，2个酚羟基的键长顺序为9—OH键长小于7—OH键长。由以上分析可知，4种化合物的C7位均为最大活性位点，因此从      C7—OH的键长判断化合物的抗氧化能力由大到小的顺序为异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷。

2.2  NBO（Natural Bond Orbital） 电荷分析

亲电基团容易进攻带负电荷多的原子，亲核基团容易进攻带正电荷多的原子。人体内的自由基主要为带负电荷的氧自由基，所以酚羟基H原子就成为抗氧化反应中的活性位点，酚羟基H所带的正电荷越大，与氧自由基的相互吸引作用越强，化合物的抗氧化活性越强。计算所得的酚羟基H原子的NBO电荷列于表2。

由表2数据可看出4种化合物C7位羟基氢上所带电荷都稍偏大，所以判断C7位是自由基反应的最大可能活性位点。4种化合物C7位羟基H所带的正电荷由大到小顺序为异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷，由此推测抗氧化活性由大到小顺序为：异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷，与前面的键长分析结果一致。

2.3  酚羟基的键解离焓和电离势分析

抗氧化剂的抗氧化机理可以根据化合物酚羟基的键解离焓（BDE）和电离势（IP）来进行分析。抽氢反应机理是由最低的BDE值决定，单电子转移反应机理是由最低的IP值决定。为此，分别在B3LYP/6-31+G**水平上计算了BDE和IP值。模拟水提和醇提对化合物抗氧化活性的影响[9-11]，表3列出了不同溶剂中的BDE，表4列出了IP值。

为了考察4种黄酮化合物中各个位置酚羟基的抗氧化能力，分别对每个位置的酚羟基失去H后的自由基进行计算，通过比较各个位置的BDE值，来判断化合物的最大反应活性位点。而张鑫[15]等只对失去C7位酚羟基H后的自由基进行了计算。由表3中4种化合物的BDE值可见，对于甘草素来说，不管是在气相中还是在溶液中，7—OH的BDE值都是最低的，这就表明C7—OH是最大反应活性位点;分析异甘草素和异甘草苷的BDE值可知，    C7—OH的BDE值也是最低的;这些结果与前面的键长和电荷分析结果一致。在气相和溶剂中，4种化合物的BDE值由大到小顺序为：甘草苷、甘草素、异甘草苷、异甘草素，这就表明其抗氧化活性由大到小顺序应该为：异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷。对于甘草素和异甘草素来说，C4′—OH的BDE值略高于C7—OH，说明C4'—OH对化合物的抗氧化活性有贡献，这可能也是导致成苷后抗氧化活性降低的原因之一。

考查溶剂效应对抗氧化机理的影响，由表3可见，随着溶剂极性的增加，BDE值增大，化合物抗氧化活性减弱，说明溶剂的极性会影响抗氧化剂的抗氧化机理。LITWINIENKO[19]等研究苯酚与自由基在各种溶剂中的反应机理发现，抗氧化机理与溶剂的体积、介电常数和溶剂化能力有关。他们指出在介电常数小的溶剂中，抽氢反应机理是主要的。因此，可以得出在非极性溶剂中，4种甘草黄酮类化合物的抗氧化机理以抽氢反应机理为主。

由表4中数据可知，在气相中甘草苷的电离势IP值最大，为205.96 kcal·mol-1，异甘草素的电离势IP值最小，为162.39 kcal·mol-1。在溶剂中4种化合物的IP值由小到大顺序为：异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷，由IP值判断的抗氧化活性由大到小顺序亦为：异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷，与BDE的分析结果一致。由此可知，不管是BDE的分析还是IP分析，4种化合物的抗氧化活性由大到小顺序为：异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷，计算所得的结论与崔誉蓉[7]等的实验结果及张鑫[14]等在气相中的计算结果一致。

另外，通过IP值的分析可以看出，在溶剂中，随着溶剂极性的增加，IP值依次降低，化合物的抗氧化活性增强，说明极性溶剂有利于单电子转移反应。IP值与分子的供电子能力有着直接的关系，而极性溶剂有利于电子的离域，单电子转移反应更容易进行[13-14]。这一结论与LITWINIENKO[19]等得出的溶剂对抗氧化机理影响的结论一致，他们指出在介电常数高的溶剂中，例如在水、甲醇和乙醇中，抗氧化剂以单电子转移反应为主。

2.4  前线分子轨道能级分析

根据前线分子轨道理论，最高占据轨道（HOMO）和最低空轨道（LUMO）对分子活性的影响非比寻常。最高占据轨道HOMO所反映的是分子给出电子的能力，HOMO轨道能量值越大，该轨道上的电子就越活泼，越容易被激发，反应就越容易进行;LUMO轨道能量值越低，则该轨道越容易接受电  子[19]。HOMO能级相对越高，HOMO和LUMO之间的能级差（?E）值越小，化学反应就越容易发生，化合物的活性就越强。4种化合物在氣相和溶剂中?E的列于表5。

根据表5中的数据分析，不管是在气相还是在溶剂中，异甘草素的能级差ΔE最低，说明异甘草素的抗氧化活性最大，然后是异甘草苷、甘草素，能级差最大的是甘草苷。所以根据前线分子轨道理论可判断，4种甘草黄酮类成分的抗氧化活性由大到小顺序为：异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷，这个结果与BDE和IP的分析结果一致，与实验结果[7]吻合。从能级差分析可得出，溶剂极性增加，能级差减小，化合物的抗氧化活性增强。因此，在极性溶剂中化合物以单电子转移反应为主，而在非极性溶剂中，则以抽氢反应为主。

3  结 论

本文通过密度泛函理论（DFT），采用B3LYP/6-31+G**方法，对中药甘草中的4种黄酮类化合物甘草素、异甘草素、甘草苷和异甘草苷的分子结构与抗氧化活性的关系进行了理论研究。在抽氢反应机理中，根据4种化合物的BDE值分析，4种化合物在气相中的抗氧化活性由大到小顺序为：异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷。而本文通过比较C4′—和C7—位酚羟基的BDE值，确定   C4'—OH对化合物的抗氧化活性有贡献，但是    C7—位酚羟基仍然是最大活性位点。另外，本文还考察了单电子转移反应机理，通过IP值分析得出的抗氧化活性由大到小顺序也为：异甘草素、异甘草苷、甘草素、甘草苷，进一步说明异甘草素的抗氧化活性是最高的。同时为了模拟真实的实验环境，以水、甲醇和乙醇为溶剂，考察溶剂效应对化合物抗氧化活性的影响，得出在抽氢反应中，随着溶剂极性的增加，抗氧化活性减弱;而在单电子转移反应中，随着溶剂极性的增加，抗氧化活性增强，与之前的研究结论是一致的[13]。因此，在极性溶剂中化合物以单电子转移反应为主，而在非极性溶剂中，则以抽氢反应为主。

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