鱼腥草可溶性粉的抗菌试验探究

吴长屏 顾丽群

【摘要】目的：探究新剂型鱼腥草可溶性粉的抗菌作用。方法：抗菌试验采用体外最小抑菌浓度法和牛津杯法，测定鱼腥草可溶性粉的最小抑菌浓度和抑菌圈直径。结果：鱼腥草可溶性粉对大肠杆菌的抑菌圈直径为14.58±0.15mm，其MIC值为125mg/mL;鱼腥草可溶性粉对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为16.42±0.15mm，其MIC值为62mg/mL。结论：说明鱼腥草可溶性粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，尤其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用较好。

【关键词】可溶性粉;金黄色葡萄球菌;大肠杆菌

如今，畜牧业集约化养殖模式不断发展，各种传染性疾病越来越严重影响到畜牧业的健康发展，一般治疗药物主要是抗生素，抗生素以高效率为特征，被广泛用于预防和治疗畜禽疾病，然而长期使用抗生素会导致细菌耐药性的产生、药物毒副作用的累积、药物残留所致的畜产品等安全问题。中药治疗效果很少出现类似抗生素所致的毒副作用，中药属于天然药物，来源多、分布广、价格低廉、无毒副作用，具有广阔的发展空间。为实现中药为现代养殖业服务的目的，加强中药的现代化研究，开发新剂型中药的应用成为发展的重要环节。

本试验旨在研究鱼腥草可溶性粉的抗菌作用，为此，在体外进行试管二倍稀释法、牛津杯法的试验，确定其量效关系，为鱼腥草可溶性粉应用于临床抗菌方面提供理论支撑。

1、材料

1.1菌种

大肠杆菌ATCC25922（购于重庆市中检所）;金黄色葡萄球菌CUCC1822（购于重庆市中检所）

1.2主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）;SW-OJ-2FD型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）;YP1200型电子天平（上海精科试验仪器有限公司）BS-1E数显振荡培养箱（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）;微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）;滤头（上海市新亚净化器厂）;81M270129麦氏比浊管（珠海贝索技术有限公司）;10uL至1000uL移液枪（Eppendorf Ltd.Co）

1.3试剂

营养肉汤（青岛高科园海博生物技术有限公司，批号：20140312）;营养琼脂（北京陆桥科技有限公司，批号：20120330）

2、方法

2.1生理盐水的制备。称取0.9gNacl加入100mL的蒸馏水中搅匀即得。

2.2中药药液的制备。称取4.29g的鱼腥草可溶性粉，用10mL的蒸馏水溶解搅匀，置于121℃高压灭菌锅内灭菌30分钟即可。

2.3营养肉汤的制备。称取营养肉汤粉1.8g，加热溶解于100mL蒸馏水中，分装三角瓶内，121℃高压灭菌20分钟，37℃恒温培养箱中过夜观察有无污染，选取无污染的的肉汤于4℃低温保存备用。

2.4培养基的制备。称取营养琼脂33g加入1000mL蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌锅内灭菌20分钟，在冷却至40～50℃时倒入平皿中，每个平皿约15mL，紫外照射5min后于37℃恒温培养箱中过夜观察有无菌落，选取无菌落的培养基于4℃低温保存备用。

2.5菌液制备。活化标准菌种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，首先将供试菌种接种在适于生长的培养基内，置于37℃恒温培养箱中培养24h，待菌种复壮后使用。再取复壮的菌种，接种到营养肉汤中，置于37℃恒温箱中培养24h备用。采用麦氏比浊法测大肠杆菌浓度、金黄色葡萄球菌浓度，分别为8×108CFU、7×108CFU，用灭菌生理盐水稀释菌液，将其稀释至108/mL的含菌量 。

2.6试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度。取无菌试管10只按顺序编号，1-8管各加1mL营养肉汤，以无菌操作在第1管内加入含1g/mL生药的中药药液1mL，用移液枪混匀后吸取1mL加入到第2管中，混匀，再取1mL至第3管，依次倍比稀释至第7管，混匀后自第7管弃去1mL，第8管不加药液作为对照管，第9管为药液对照管，第10管为药液加肉汤的对照管，然后1到7管每管加入0.1mL目标菌液，在无菌环境中操作结束后置于37℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。试验重复进行三次，操作如表1：

结果判定：以能抑制细菌生长的中草药最高稀释度作为中草药的最低抑菌浓度。

2.7牛津杯法测鱼腥草可溶性粉敏感性试验。在营养琼脂平板上，用L型玻璃棒蘸取目标菌液在琼脂表面均匀涂布，以无菌操作将灭菌的不锈钢牛津杯，放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。平板上均匀放4支小管。待1min后，分别向各小管中滴加1g/mL生药的中药药液200μL的药液，勿使其外溢。置于37℃恒温培养箱中培养18～24h，观察结果。结果判定：抑菌圈直径>20mm为极敏，抑菌圈直径15～20mm为高敏，抑菌圈直径10～15mm为中敏，抑菌圈直径<10mm为低敏，无抑菌圈为不敏感。试验重复进行三次，求出抑菌圈直径的平均值。

3、试验观察记录 观察记录混浊和未混浊的试管数;测量抑菌圈的大小，每个抑菌圈测量三次计算平均数并记录。

4、数据处理 采用Excel进行数据收集与处理，再用SPSS20.0统计软件对数据进行显著性检验和方差分析，所有数据均用平均数±标准差表示。

5、试验结果

5.1最小抑菌浓度测定结果

在37℃恒温培养箱中培养24h后，取出试管，肉眼观察药物抑菌效果，判断细菌生长情况，对于大肠杆菌，从第4管开始变浑浊，最小抑菌浓度（MIC）为1/8，对于金黄色葡萄球菌，从第5管开始变浑浊，最小抑菌浓度（MIC）为1/16，结果显示如表2

5.2牛津杯法测鱼腥草可溶性粉敏感性试验结果

在37℃恒温培养箱中培养24h后，取出琼脂平板，肉眼观察各种药物的抑菌效果，并测量各抑菌圈的直径大小。鱼腥草可溶性粉对大肠杆菌的抑菌圈平均直径为14.58mm，呈中度敏感，鱼腥草可溶性粉对金黄色葡萄球菌抑菌圈直徑为16.42mm，呈高度敏感。结果显示如表3

6、分析讨论

一般而言，清热药为中草药中抑菌的首选药物，鱼腥草具有清热解毒的功效，中药抑菌试验方法有两种，一种是定性分析法，一种是定量分析法。定性分析法一般采用管碟法、药敏纸片法和平皿稀释法。定量分析法有试管二倍稀释法、平皿打洞法、杯管法等。这些方法都可以作为体外抗菌作用的研究方法。本试验从定性、定量分析两个方面出发，再根据实验室已有资源的可操作性，因此选择了试管二倍稀释法、管碟法对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行了抑菌试验。试验过程中难免受到来自细菌接种量、培养基等的影响。因此，应尽量统一标准、材料、可控的实验条件，进行多次的重复，才能使结果更客观可靠。

本试验从以上结果可看出， 鱼腥草可溶性粉对大肠杆菌为中敏，对金黄色葡萄球菌为高敏，鱼腥草可溶性粉对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌有高度抑制作用，对痢疾杆菌、大肠杆菌有中度抑制作用。

结论：通过试管二倍稀释法和牛津杯法试验，结果表明鱼腥草可溶性粉对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，尤其对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好。

参考文献：

[1]寇晓晶，吴润，贾帅，等.自拟中药复方制剂对畜禽肠道腹泻病原菌的体外抑菌试验[J].中兽医学杂志，2014（01）：9-13.

[2]刘荣欣，鲁改儒，郭吉勇.中药及其组方对大肠杆菌的体外抑菌试验[J].安徽农业科学，2011（04）：2265-2267.

[3]袁婷，钟学稳.常见中草药的体外抑菌试验[J].畜牧兽医科技信息，2009，09：23-25.

[4]姚火春.兽医微生物实验指导[M].北京：中国农业出版社，2006.