小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定方法比较与分析

王韦岗，项厚生，吴海峰，李 丹，陆 源

(1 江苏国测检测技术有限公司，江苏 昆山 215300； 2 镇江市产品质量监督检验中心,江苏 镇江 212132)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素，是镰刀菌属禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等的次级代谢产物，是一种常见的真菌毒素，其广泛存在于小麦、大麦、玉米等粮食作物中[1-2]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇对谷物的污染率和污染水平居镰刀菌毒素之首，是各国重点控制的真菌毒素之一[3]，主要原因是谷物在田间受到禾谷镰刀菌等真菌侵染，导致小麦发生赤霉病和玉米穗腐病，在适宜的气温和湿度等条件下繁殖并产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对动物和人均有一定毒性，长期大量摄入含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇的食品会抑制蛋白质的合成，造成呕吐、腹泻、厌食、恶心、神经紊乱等毒性效应[4]。脱氧雪腐镰刀菌烯醇的性质十分稳定，烘焙、高温、高压等食品加工方法对它的影响很小，120 ℃的高温仍然不能使其降解，加碱或高压处理才可破坏部分毒素[5-6]。为减少脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人类的危害，目前很多地区和国家都制订了相应的标准来限制粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》规定谷物及其制品(玉米、玉米面(渣、片)、大麦、小麦、麦片、小麦粉)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为1000 μg/kg[7]。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法主要有酶联免疫法[8-9]、高效液相色谱法[10-11]和液相色谱-串联质谱法[12-14]等。酶联免疫方法通常用于快速筛查，该方法受样品基质干扰较大，容易出现假阳性；液相色谱-串联质谱法仪器昂贵，不易于推广；高效液相色谱法具有灵敏度高、重复性好等特点，广泛用于真菌毒素的测定分析。本文以小麦粉为待测样品，分别采用直接浸提法、固相萃取柱法和免疫亲和柱法对小麦粉样品进行前处理，采用高效液相色谱法测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，并对这3种前处理方法进行了比较分析。

1 实 验

1.1 材料与试剂

甲醇(色谱纯)，默克公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、盐酸均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；聚乙二醇(相对分子质量8000)，Sigma-Aldrich；乙腈中脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液(100 μg/mL)，北京坛墨质检科技有限公司；Poly-Sery HLB Pro固相萃取柱(60 mg/3 mL)，上海安谱实验科技股份有限公司；脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱(柱容量≥1500 ng)，北京康源泰博生物科技有限公司；小麦粉中呕吐毒素定量分析质控样品，中国检验检疫科学研究院测试评价中心；PBS缓冲盐溶液：称取8.0 g氯化钠、1.2 g磷酸氢二钠、0.2 g磷酸二氢钾、 0.2 g氯化钾，用900 mL水溶解，用盐酸调节pH 至7.0，用水定容至1000 mL。

1.2 仪器与设备

Ultimate3000液相色谱仪，赛默飞世尔科技公司；WH-2微型漩涡混合仪，江苏省兴化市分析仪器厂；TG16台式低速自动平衡离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；GH-800DTS超生波清洗机，北京国环高科自动化技术研究院；SBEQ-CG1416固相萃取真空装置，上海安谱实验科技股份有限公司；PS-DCY氮吹仪，常州普森电子仪器厂。

1.3 仪器分析条件

色谱柱：CNW Athena C18-WP (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇:水=20:80；流速：0.8 mL/min；进样体积：50 μL；柱温：30 ℃；检测波长：218 nm。

1.4 样品前处理

1.4.1 样品提取

称取5 g样品于50 mL离心管中，加入1 g聚乙二醇，准确加水25 mL，旋涡振荡提取5 min，4000 r/min离心5 min后将上清液过滤至25 mL具塞比色管中，准确吸取10 mL滤液待净化或测定。

1.4.2 免疫亲和柱净化

将低温保存的免疫亲和柱恢复至室温，待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将1.4.1的10 mL滤液全部转移至免疫亲和柱中，控制样液以每秒1～2滴的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入免疫亲和柱。用3 mL PBS缓冲盐溶液和3 mL水先后淋洗免疫亲和柱，控制淋洗液以每秒1～2滴的流速通过免疫亲和柱，弃去全部流出液，抽干小柱。

加入2 mL甲醇洗脱免疫亲和柱，控制洗脱液以每秒1～2滴的流速通过免疫亲和柱，收集全部洗脱液至5 mL烧杯中，在60 ℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，准确加入1.0 mL水，超声30 s溶解残留物，0.45 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

1.4.3 固相萃取柱净化

分别用3 mL甲醇和3 mL水活化HLB固相萃取柱，将1.4.1的10 mL滤液全部转移至HLB固相萃取柱中，控制流速为每秒1～2滴。用3 mL水、1 mL 5%甲醇-水溶液依次淋洗HLB固相萃取柱，抽干小柱。用4 mL甲醇洗脱HLB固相萃取柱，收集全部洗脱液至5 mL烧杯中，在60 ℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，准确加入1.0 mL水，超声30 s溶解残留物，0.45 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

2 结果与讨论

2.1 标准溶液的测定及线性关系

准确吸取一定体积的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液，用水稀释成浓度为0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL和5.0 μg/mL的标准工作溶液。按照上述色谱条件对标准工作溶液进行测定，以样品峰面积Y(mAU)对质量浓度X(μg/mL)作图，得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇的线性回归方程为Y=1.1266X-0.0016，相关系数R2为0.9999，结果表明，采用外标峰面积法定量，脱氧雪腐镰刀菌烯醇在相应的浓度范围内均具有良好的线性关系。脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作溶液色谱图见图1。当信噪比(S/N)为3:1时，该方法的检出限(limits of detection，LOD)为50 μg/kg。

图1 标准工作溶液色谱图

2.2 净化柱性能测试

在对小麦粉样品测定之前，先采用标准工作溶液分别测试HLB固相萃取柱和免疫亲和柱对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回收率。测试方法如下：准确吸取一定体积脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液，用水稀释至10 mL，配制成浓度为0.10 μg/mL的标准工作溶液，待净化；然后分别按照1.4.2和1.4.3的方法对上述10 mL待净化液进行净化、浓缩，复溶并定容至1 mL，过滤膜后进样测定。测试结果表明，HLB固相萃取柱和免疫亲和柱对脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作溶液均具有较好的回收率，其中HLB固相萃取柱的回收率为92.34%；免疫亲和柱的回收率为90.51%。

2.3 溶剂对测定结果的影响

采用液相色谱法测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，溶剂是影响测定结果的重要因素。脱氧雪腐镰刀菌烯醇在乙酸乙酯中具有较好的稳定性，因此有些厂商采用乙酸乙酯配制脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液，然而采用液相色谱法测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，乙酸乙酯在此测定条件下也能出峰，其响应值要远大于脱氧雪腐镰刀菌烯醇，从而容易引起误判和干扰。

除了乙酸乙酯会干扰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定，溶剂效应是干扰测定的另一因素。甲醇、乙腈也是配制脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液的常用溶剂，然而采用这两种溶剂对标准溶液进行稀释时，溶剂效应非常明显。当采用甲醇或者乙腈稀释标准溶液时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的色谱峰会出现鼓包、双峰或者响应值变低等现象。因此采用液相色谱法测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，建议用纯水为溶剂稀释标准溶液，同时采用固相萃取柱或者免疫亲和柱净化、浓缩后，用纯水进行复溶。

2.4 样品前处理方法对色谱图的影响

以市售小麦粉为待测样品，按照上述色谱条件，分别对1.4.1的样品浸提液、1.4.2和1.4.3的净化液进行测定，测定结果见图2～图4。从图2中可以看出，采用样品浸提液进行测定时，色谱图中杂质组分的响应值较大，响应值高达400 mAU，而样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的响应值小于10 mAU，杂质组分与脱氧雪腐镰刀菌烯醇的保留时间接近，从而杂质组分对脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定有很大的干扰，不利于定性和定量。小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量值为1000 μg/kg，当样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量达到限量值时，按照1.4.1方法处理后的浸提液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量仅为0.20 μg/mL，此时色谱峰响应值较小，在杂质组分的干扰下容易出现假阴性的结果。图3是浸提液经HLB固相萃取柱净化后测定的色谱图，经过HLB固相萃取柱净化后，杂质组分减少，杂质组分的响应值明显降低，但是色谱图的基线噪音较大，脱氧雪腐镰刀菌烯醇保留时间附近仍有一些小杂峰，对色谱峰的积分产生影响，增加淋洗液体积后，杂质组分干扰现象消失。图4是浸提液经免疫亲和柱净化后测定的色谱图，免疫亲和柱净化的基础是抗原抗体反应[15]：将脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异性抗体结合在免疫亲和柱内的凝胶上，当含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浸提液经过免疫亲和柱时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇在免疫亲和柱内与抗体结合，然后用溶剂洗涤免疫亲和柱，除去柱内未被结合的其他杂质，最后再用甲醇破坏抗原抗体的结合，将脱氧雪腐镰刀菌烯醇洗脱下来，从而达到富集和净化的效果。从图4中可以看出，经过免疫亲和柱净化后，杂质组分明显减少，基线噪音变小，同时，经过免疫亲和柱的富集和洗脱液的浓缩作用，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的响应值变大，方法的检出限变小。测定结果表明，本次测定的市售小麦粉中检出了脱氧雪腐镰刀菌烯醇，其含量约为430 μg/kg，符合GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中规定的限量要求。

图2 浸提液直接测定样品色谱图

图3 固相萃取柱净化后样品色谱图

图4 免疫亲和柱净化后样品色谱图

2.5 样品前处理方法对回收率和精密度的影响

称取一定质量的市售小麦粉9份，分3组，分别加入低、中、高浓度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液，按照1.4.1、1.4.2和1.4.3的方法进行前处理和测定，同时，对加标样品重复测定6次，考察不同前处理方法对回收率和精密度的影响。测定结果表明，当采用浸提液直接进行测定时，由于杂质组分的干扰，低浓度加标样品的回收率和测定结果的精密度均较差，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)大于10%，影响样品定量分析结果的准确性；HLB固相萃取柱和免疫亲和柱净化后可以去除浸提液中大部分杂质组分，消除杂质组分对脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定的影响，从而提高样品的回收率和测定结果的精密度。由于免疫亲和柱对脱氧雪腐镰刀菌烯醇具有特异性吸附的作用，因此采用该柱净化后的样品更为干净，不同浓度加标样品的测定结果均具有很好的精密度，相对标准偏差(RSD)在1.8%～2.4%之间。然而，采用免疫亲和柱对浸提液进行净化时，加标样品的回收率又会受到柱容量的影响。当小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的添加量为1000 μg/kg时，加标样品浸提液经免疫亲和柱净化后回收率下降至54.9%。免疫亲和柱柱容量验证实验发现，该免疫亲和柱的柱容量约为2000 ng，加标样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量已经超过了免疫亲和柱的柱容量，从而导致吸附过载，回收率下降。过免疫亲和柱时，将该加标样品的上样量减少至2 mL，重新测定后免疫亲和柱的回收率为91.3%。

表1 3种方法处理样品的回收率与精密度试验结果(n=6)

2.6 样品前处理方法对测定结果的影响

采用不同前处理方法对小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量分析质控样品进行处理和测定，质控样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的特征值为1336.9 μg/kg，特征值区间为943.6～1730.2 μg/kg。为避免免疫亲和柱的柱容量出现过载，质控样品的称样量为1 g，测定结果表明，采用浸提液直接测定时，脱氧雪腐镰刀菌烯醇保留时间附近出现干扰峰，杂质组分干扰了脱氧雪腐镰刀菌烯醇的定性与定量；固相萃取柱法和免疫亲和柱法净化后干扰组分消失，测定结果分别为1155.13 μg/kg和1205.39 μg/kg，在特性值区间范围内。以特性值1336.9 μg/kg为标准值计算回收率分别为86.40%和90.16%，小麦粉样品经免疫亲和柱净化后脱氧雪腐镰刀菌烯醇的回收率略高于HLB固相萃取柱净化后测定的结果，同时也进一步证明这两种前处理方法能够适用于小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。

3 结 论

本文建立了高效液相色谱测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分析方法，比较了3种前处理方法对测定结果的影响。3种前处理方法相比较，各有优缺点。直接浸提法虽然操作简便，成本低廉，但是容易受到样品中杂质组分干扰，样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量较低时回收率和精密度均较差；固相萃取柱法能够去除浸提液中的大部分杂质组分，同时具有富集和浓缩的作用，测定结果稳定，精密度高，低、中、高不同浓度加标样品的回收率均在85%以上；免疫亲和柱法与固相萃取柱法相比，具有更好的选择性、专一性和净化效果，该方法受样品基体干扰影响最小，但是免疫亲和柱价格稍高，且具有专一性，使用时容易受到柱容量的影响。