芥子碱硫氰酸盐对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移和侵袭的影响及机制

陈腾祥，王婧雅，曾智锐，雷 珊，薛 燕，孙远梅，杨宇石，兰金芝

( 贵州医科大学 1.基础医学院生理学教研室、贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室、2. 附属医院病理科、3. 贵州省再生医学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

原发性肝癌是我国死亡率排名第2位的恶性肿瘤。虽然当前肝癌以现代医学的治疗方法为主，但是中医药辨证论治在中晚期肝癌和术后不良反应中发挥重要的作用。其优点有降低毒副作用、症状明显减轻或带瘤生存期延长[1-2]。芥子碱硫氰酸盐(sinapine thiocyanate)存在于十字花科药用植物之中，是一种季铵盐，具有抗炎、抗氧化、抗辐射、抗衰老、降压、抗雄激素活性、抑制新生血管生成等功效, 是一种值得探索的天然药物[3-4]。然而，芥子碱对肝癌细胞作用及其作用机制，尚不明确。本研究探究芥子碱硫氰酸盐对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，以及对前列腺素内过氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1，PTGS1)和前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)的影响，以期为肝癌治疗的新药研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 肝癌细胞SMMC-7721(货号:3131C0001000700052)购自北京国家实验细胞资源共享服务平台。

1.1.2试剂 DMEM细胞培养基(货号:12100046)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS；货号:FBS10099-141)和0.25%浓度的胰酶(货号:25200-072)购自美国Gibco生物公司；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO；货号:D2650)购自美国Sigma；细胞增殖与毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8；货号:CK04)购自日本同仁生物；Transwell小室(货号:3422)购自美国康宁生物公司；matrigel胶(货号:356234)购自美国BD生物公司；高效蛋白裂解液(货号:P0013B)、蛋白酶抑制剂PMSF(货号:ST505)、制胶试剂盒(货号:P0690)和BCA定量试剂盒(货号:P0012)购自杭州碧云天生物；多克隆抗体PTGS1(货号:13393-1-AP)、PTGS2(货号:12375-1-AP)、Bax(货号:50599-2-Ig)、Bcl-2(货号:12789-1-AP)、MMP-2(货号:10373-2-AP)、MMP-9(货号:10375-2-AP)和单克隆抗体β-actin(货号:66009-1-Ig)购自武汉三鹰生物公司；山羊抗兔(货号:AS014)和山羊抗鼠二抗(货号:AS003)购自武汉爱博泰克生物公司；ECL高敏曝光液(货号:36222ES60)购自武汉聚能生物公司；芥子碱硫氰酸盐(纯度>98%；货号:HY-N0450)购自武汉MCE生物公司。

1.1.3仪器 细胞培养超净工作台(型号:SW-CJ-2D)购自苏州净化设备有限公司；细胞恒温培养箱(型号:HERAcell 240i)购自美国Thermo公司；多功能酶标仪(型号:Epoch)购自美国BioTek公司；倒置显微镜(型号:CX23)购自日本奥林巴斯公司；Western blot凝胶成像系统(型号:Biorad GelDoc XR)购自美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及药物配制 肝癌细胞SMMC-7721用高糖DMEM培养基(含10%FBS)置于37 ℃、5% CO2的培养箱培养。待细胞长至80%时，胰酶消化后传代。状态良好的细胞用于后续实验。芥子碱硫氰酸盐粉末用DMSO配制成10 mol·L-1浓度的母液，过滤除菌后置于-20 ℃储存；使用时用DMEM培养液稀释成各个浓度的工作液。

1.2.2CCK-8实验检测细胞存活 胰酶消化处于对数生长期的SMMC-7721细胞，制备细胞悬液。细胞计数后，于96孔板每孔种植3×103个细胞，每组设置6个复孔。待细胞贴壁后，分别用25、50和100 μmol·L-1浓度的芥子碱硫氰酸盐处理细胞，以添加含有等体积DMSO的DMEM培养液(即0 μmol·L-1)为对照组。药物处理48 h后，弃掉培养基，每孔加入含10 μL CCK-8液的100 μL无血清DMEM培养基。置于培养箱中培养2 h。用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光度。

1.2.3划痕实验检测细胞迁移能力 肝癌细胞SMMC-7721以每孔2×105个的密度接种于6孔板中，置于培养箱培养至至汇合度达95%以上。用200 μL移液器枪头细胞单层上做划线。PBS漂洗3次后，添加含不同浓度(25、50和100 μmol·L-1)芥子碱硫氰酸盐的无血清DMEM培养液。对照组则加入含等体积DMSO的无血清DMEM培养液。在划痕后0和24 h，随机选取5个视野在倒置显微镜下进行拍照。划痕面积在Image Pro Plus软件中测量，每组的相对迁移率用以下公式计算:相对迁移率/ %=(各药物组0 h划痕面积-24 h划痕面积)/(对照组0 h划痕面积-24 h划痕面积)×100%。

1.2.4Transwell小室法检测细胞侵袭能力 以1 ∶8的体积比混匀Matrigel胶和无血清DMEM培养基后铺到Transwell的上室中。在37 ℃培养箱烘干matrigel后吸掉多余培养基。肝癌细胞SMMC-7721重悬后取200 μL含4×104个细胞的悬液滴置于上室里，再分别加入不同浓度(25、50和100 μmol·L-1)芥子碱硫氰酸盐，对照组加入等体积DMSO。下室放置700 μL含10% FBS的DMEM培养基。24 h后以4%多聚甲醛固定Transwell小室，PBS漂洗2次后，结晶紫染色15 min。用棉签擦拭掉非侵袭细胞后，每孔随机选取5个视野拍照。

1.2.5蛋白靶点分析 利用在线数据库Targetnet(http://targetnet.scbdd.com/home/index/)，导入化合物的化学结构式，基于QSAR模型预测化合物作用的蛋白靶点。得到作用的蛋白靶点信息后，应用Cytoscape软件对芥子碱硫氰酸盐调控的蛋白靶点可视化。进一步把蛋白靶点信息导入至在线数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)中进行通路富集分析。P<0.05的通路则为显著性富集的通路。

1.2.6计算机分子对接 从Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)数据库中下载PTGS1蛋白的晶体结构(ID: 6Y3C)和PTGS2蛋白的晶体结构(ID: 5IKR)。同时，从PubChem Compound数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)下载芥子碱硫氰酸的三级结构。PTGS1蛋白的晶体结构、PTGS2蛋白的晶体结构和芥子碱硫氰酸的三级结构均导入到SYBYL软件，对蛋白晶体结构清除原结合分子、修复粘性末端和加氢处理。以自动识别模式识别蛋白的活性口袋后，运用DOCKING功能对接芥子碱硫氰酸与PTGS1和PTGS2的活性口袋，根据结合打分(C-score:0～5)判断分子与蛋白稳定结合的可能性。C-score在4～5分范围则可认为分子与蛋白能够稳定结合。

1.2.7Western blot检测PTGS1、PTGS2、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9的表达变化 用不同浓度(25、50和100 μmol·L-1)的芥子碱硫氰酸盐和含等体积DMSO的DMEM培养基处理肝癌SMMC-7721细胞24 h后，弃掉培养基，用含2% PMSF蛋白酶抑制剂的预冷强效裂解液裂解细胞。离心后，吸取蛋白上清液后以BCA法进行定量。25 μg蛋白经10%分离胶90 V恒定电压电泳2 h后，300 mA恒流2 h转至PVDF膜上。常温下封闭2 h，分别加入稀释度为1 ∶1 000的一抗PTGS1、PTGS2、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9和β-actin在4 ℃过夜。TBST洗涤3次，加入稀释度为1 ∶2 000的二抗在室温摇床中孵育2 h。滴加高敏ECL曝光液后于成像仪中进行显影。测量条带的灰度值后，以β-actin为内参，计算蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 芥子碱硫氰酸盐明显抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖CCK-8结果显示，0、25、50和100 μmol·L-1的芥子碱硫氰酸盐处理48 h后，各组肝癌细胞SMMC-7721的增殖率依次为(100±6.8)%、(85.1±7.1)%、(59.2±10.9)%和(39.8 ± 6.2)%(Fig 1)。与对照组相比，各组增殖率均明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。提示芥子碱硫氰酸盐能够明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖。

Fig 1 Effects of different concentrations of sinapine thiocyanate on SMMC-7721 proliferation at 48 h n=3)

2.2 芥子碱硫氰酸盐抑制肝癌细胞SMMC-7721迁移划痕实验结果显示，0(即对照组)、25、50和100 μmol·L-1芥子碱硫氰酸盐处理组的SMMC-7721细胞的相对迁移率分别为(100.0 ± 9.2)%、(77.1 ± 7.2)%、(48.2 ± 10.4)%和(35.1 ± 7.1)%(Fig 2)。与对照组相比，各组SMMC-7721细胞相对迁移率均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。提示芥子碱硫氰酸盐能够明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的迁移。

2.3 芥子碱硫氰酸盐抑制肝癌细胞SMMC-7721侵袭Transwell小室实验结果显示，0(即对照组)、25、50和100 μmol·L-1芥子碱硫氰酸盐处理组的每视野下侵袭过膜的细胞数分别为(206 ± 22)个、(116 ± 13)个、(67 ± 12)个和(37 ± 8)个(如Fig 3)。与对照组相比，各浓度处理组中肝癌细胞SMMC-7721的侵袭能力均明显减弱，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 芥子碱硫氰酸盐作用的蛋白靶点预测及通路富集分析利用在线数据库Targetnet，预测出27个芥子碱硫氰酸盐作用的蛋白靶点(Fig 4A)。对27个芥子碱硫氰酸盐作用蛋白靶点进行通路富集分析，结果显示，芥子碱硫氰酸盐的蛋白靶点明显富集的通路在氮代谢、含有血清素的神经突触调控、脂肪细胞内脂肪细胞的分解调节以及花生四烯酸代谢等4个通路上(Fig 4B)。其中，蛋白靶点PTGS1和PTGS2富集在包括含有血清素的神经突触调控、脂肪细胞内脂肪细胞的分解调节以及花生四烯酸代谢等在内的多个信号通路中(Tab 1)。因此，PTGS1和PTGS2被视为芥子碱硫氰酸盐的核心作用靶点。

2.5 计算机分子对接芥子碱硫氰酸盐与PTGS1和PTGS2蛋白的活性口袋为进一步探讨芥子碱硫氰酸盐对核心作用靶点PTGS1和PTGS2的调控，我们进行了计算机分子对接。结果显示，芥子碱硫氰酸盐均能与PTGS1和PTGS2的活性口袋结合，并“包埋”在活性口袋内，C-score得分(0～5)分别为4分和5分(Fig 5)。结果显示芥子碱硫氰酸盐能够稳定结合PTGS1和PTGS2蛋白，提示其发挥功能可能是通过调控PTGS1和PTGS2蛋白介导的。

2.6 芥子碱硫氰酸盐对PTGS1、PTGS2、Bax、Bcl-2、MMP-2和MMP-9表达的影响用不同浓度(0、25、50和100 μmol·L-1)的芥子碱硫氰酸盐处理肝癌细胞SMMC-7721后，蛋白质印迹法检测结果显示，与对照组(即0 μmol·L-1芥子碱硫氰酸盐组)相比，各浓度处理组肝癌细胞中PTGS1、PTGS2、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白的相对表达量均明显减少，Bax蛋白的相对表达量明显增加，差异均具有统计学意义(Fig 6，P<0.05)。结果提示，芥子碱硫氰酸盐可能是通过靶向抑制PTGS1和PTGS2的表达，进而减少SMMC-7721细胞的增殖、迁移和侵袭。

Tab 1 Enrichment analysis of targets of sinapine thiocyanate

Fig 2 Effects of sinapine thiocyanate on SMMC-7721 on migration of hepatocellular carcinoma cells by wound healing assay(×40) n=3)

Fig 3 Effects of sinapine thiocyanate on invasion of SMMC-7721 hepatocellular carcinoma cells by

3 讨论

肝癌是一类预后极差的恶性消化系统肿瘤,由于发病隐匿、进展迅速，患者的死亡率较高。目前，肝癌临床治疗方法主要有外科干预和全身疗法[5]。当前, 肝癌的发生机制尚不明确[6]。但肝癌早期发病隐匿,病情发展迅速,且易发生浸润和转移,所以大部分患者就诊时已错过最佳的手术治疗时间。应用中药或中药有效成分治疗肝癌许多优势,如缓解术后不良反应、增强免疫力、协同化疗药物，以及提高生活质量等[7-8]。

Fig 4 Bioinformatics analysis for targets of sinapine thiocyanate

Fig 5 Stable binding of sinapine thiocyanate to active pocket of PTGS1 and PTGS2 shown by computer molecular docking C-score ≥ 4 was set as cut-off to consider the stable binding

芥子碱硫氰酸盐是十字花科药用植物中的一种季铵盐提取物，在包括肿瘤在内的多种疾病中都有着明显作用。Li等[9]发现，钩藤总碱与芥子碱硫氰酸盐联合使用能够下调凝血相关酶的表达，从而抑制血管内皮的促凝状态。刘晓莉等[10]表明，芥子碱对多种乳腺癌细胞均有抑制作用。Fan等[11]研究发现硫氰酸芥子碱的经皮吸收可对哮喘有治疗作用。本研究应用CCK-8实验、划痕实验和Transwell小室实验，发现芥子碱硫氰酸盐能够明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭。提示芥子碱硫氰酸盐是一种有潜力的抗肝癌药物。

PTGS也被叫做环氧合酶，是合成前列腺素等的产物的关键酶体。PTGS有两种同功酶，即结构型的PTGS1和诱导型的PTGS2。在生理状态下，这两种同工酶的表达以及功能上是有明显的区别[12]。PTGS1是一种具有重要生理意义的前列腺素合成酶。PTGS1是一种固有的管家酶，主要在胃、肾和血小板中表达，其基本功能包括调节外周血管阻力、维持肾血流量、保护胃粘膜和调节血小板聚集。PTGS1也被认为在炎症、关节炎和癌症的病理生理过程中起关键作用[13]。在正常组织中PTGS2含量极少,其可推动花生四烯酸转化为前列腺素，在缺氧、炎症因子、致癌物质、生长因子等条件下可促进PTGS2的表达[14]。目前，大量研究表明，PTGS1和PTGS2在肝癌中高表达，且与肝癌的进程有着密切关系。如PTGS2可激活WNT/2表达，且与肝癌的信号通路调控人肝癌细胞VEGF表达，进而促进肝癌的增殖和转移[15]；人工合成的小分子化合物SC-560(一种选择性PTGS1抑制剂)明显抑制肝癌细胞的生长并介导细胞凋亡[16]。此外，PTGS1抑制剂与选择性PTGS2抑制剂的组合，对细胞生长抑制有协同作用。这些结果提示PTGS1和PTGS2抑制剂可能在肝癌患者中具有潜在的治疗意义[17]。在我们研究中，通过数据库预测PTGS1和PTGS2是芥子碱硫氰酸盐的核心作用靶点。同时，我们进行了计算机分子对接，发现芥子碱硫氰酸盐可以稳定结合PTGS1和PTGS2蛋白的活性口袋。我们进一步通过Western blot发现，不同浓度芥子碱硫氰酸盐能够明显抑制PTGS1和PTGS2的表达，同时均促进促凋亡因子Bax的表达量增加，减少抗凋亡因子Bcl-2和侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达量。

Fig 6 Effects of sinapine thiocyanate on expression of PTGS1, PTGS2, Bcl-2, Bax, MMP-2 and MMP-9 proteins in SMMC-7721 cells detected by Western blot n=3)

综上所述，芥子碱硫氰酸盐可能通过靶向PTGS1和PTGS2抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。芥子碱硫氰酸盐可能成为治疗肝癌的有效中药之一。