外源水杨酸对葡萄叶片黄烷-3-醇积累的影响

杨 波，卫 颖，梁长梅，张鹏飞，牛铁泉，樊玮鑫，温鹏飞

（1.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；2.山西农业大学信息科学与工程学院，山西太谷030801；3.山西农业大学实验教学示范中心，山西太谷030801）

葡萄叶片是一种来源于自然，安全无害的传统中药材，具有安胎、消肿、利尿作用，并且含有丰富的维生素和矿物质[1]，具有很高的营养价值，可用于新鲜食品（如土耳其、希腊等的菜肴[2]）的制备，也可从中提取药物添加剂[3]，因其蛋白含量丰富，亦可作为饲料添加剂，改善禽鱼肉蛋等产品质量、降低饲料消耗率。葡萄叶片中含有大量多酚类化合物，如黄酮醇、黄酮[4]、酚酸和黄烷-3-醇[5]（如儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素等）以及少量二苯乙烯（如白藜芦醇、反式白藜芦醇等）类物质[6]，具有潜在开发和利用价值。其中，黄烷-3-醇不仅参与植物本身的生长发育[7]，赋于植物抗紫外线、抗虫害、抗伤害、抗离子毒害等功能[8]，对人类健康也具有重要作用，由于其具有极强的抗氧化功能[9]，在抗菌、抗病毒、抗癌、抗血栓、抗肿瘤、降血压、降低心脏代谢风险[10]等方面具有重要作用。葡萄日常管理中，为了保证果实的质量，会多次除去植株外周叶片，作为废弃物丢弃。此外，葡萄植株每年自然脱落的叶片，多被焚烧，不但造成天然酚类物质资源的浪费，还污染环境，造成了一定的资源损耗和经济浪费。因而，对废弃葡萄叶片的酚类物质富集研究可以有效利用生态资源。

葡萄叶片中多酚类物质的合成和积累不仅受到结构基因、调节基因的调控，还受到外界条件（如光照、水分、外源激素）的影响。其中，水杨酸（Salicylic acid，SA）作为一种植物调节剂[11]，不仅能够促进植物（如大麦[12]、当归[13]）幼苗生长，而且能够促进植物细胞分裂、伸长和次生代谢物积累，诱导一系列与抗逆有关的基因表达，提高植物的抗盐性[14]、耐热性[15]和抗寒性。KUMARI等[16]研究证实，水杨酸和壳聚糖的联合处理，保持了荔枝果实中较高的花青素、总酚、类黄酮含量[17]。GHASEMZADEH等[18]研究发现，外源SA可以诱导生姜花色苷的合成。GIMÉNEZ等[19]研究发现，0.5 mmol/L SA可显著提高采收期甜樱桃果实总酚酸含量。许玉超[20]研究表明，外源SA可显著增加白菜叶片的总酚含量。IDREES等[21]、KHAN等[22]观察到叶面喷施0.5 mmol/L SA可显著提高水稻幼苗、紫花苜蓿幼苗的花青素含量。因而，外源SA对植物多酚物质，特别是总酚、花青素具有一定调控作用，但是对黄烷醇类多酚，特别是对黄烷-3-醇的积累研究鲜见报道。

本研究采用外源水杨酸（SA）孵育葡萄新梢的方法，初步探究了SA对葡萄叶片黄烷-3-醇积累的作用，为后续研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试早黑宝葡萄采自山西农业大学园艺站温室，株行距2.5 m×1.0 m，篱架栽植，常规管理。

1.2 试剂

儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯标准品、福林酚均购自索莱宝公司；乙腈、冰乙酸、无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇等试剂均购自国内国药公司。

1.3 试验方法

选取30株健康且长势基本一致的早黑宝葡萄，采集新梢（带叶柄7～10 cm），将叶柄插入锥形瓶中，以0.5 mmol/L SA孵育为处理，以蒸馏水孵育为对照（SA及蒸馏水液面高度保持在锥形瓶高度的4/5处），每个锥形瓶中插8个，5个锥形瓶为一组，9：00放于ED型光照培养箱（光照强度2 000 lx、相对湿度70%、温度25℃）中培养，分别于0、1、3、6、12、24、72、120、192、240 h取叶片于液氮中冻存待用。每个处理设置3次重复。

1.4 测定项目及方法

总酚、总类黄酮测定参照陈建业[23]方法，稍作修改。总黄烷-3-醇测定参照杨丽等[24]方法，稍作修改。黄烷-3-醇单体测定利用高效液相色谱法。

1.4.1 标准溶液的制备 分别精确称取黄烷-3-醇中的标准品儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯，用甲醇配制成1 mg/mL的标准母液，再稀释成不同浓度的工作液，-20℃保存。

1.4.2 色谱条件Themo Fisher UltiMate3000色谱仪，Syncronis C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，280μm），Dionex Ultimate 300 Diode Array Detector检测器，流动相B为1.3%冰乙酸，流速1.0 mL/min；检测波长为280 nm，柱温为30℃，进样量为5μL。

1.4.3 样品前处理 参照温鹏飞[8]方法，略有修改。葡萄叶片于液氮下迅速研磨至粉末状，准确称取0.3 g于10 mL离心管中，加入3 mL 70%甲醇，上下摇匀10次，超声波提取15 min；10 000 r/min离心10 min后取上清液2.5 mL，12 000 r/min离心10 min，取上清液，过夜浸提，经0.45μm有机微孔滤膜过滤，恒温旋转蒸发8 min后加入1 mL纯净水提取，加入2 mL乙酸乙酯，摇匀静置后取上层液体，恒温旋转蒸发5 min后用1 mL纯甲醇提取，经0.22μm有机微孔滤膜过滤后，高效液相色谱仪测定。

1.5 数据统计分析

采用Excel软件进行数据处理，使用SAS 8.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 SA孵育对早黑宝葡萄叶片总酚含量的影响

在0～6 h内，相比对照，总酚含量随SA孵育时间的加长而增加，在1 h时出现最高峰，总酚含量在1、3 h时极显著高于对照，192 h时显著低于对照，240 h时极显著低于对照，其他孵育时间与对照间无显著性差异（图1）。

2.2 SA孵育对早黑宝葡萄叶片总类黄酮含量的影响

在0～6 h内，相比对照，总类黄酮含量随SA孵育时间的加长而增加，总类黄酮含量在1 h时出现最高峰，总类黄酮含量在1、3 h时显著高于对照，12、72、240 h时显著低于对照，192 h时极显著低于对照，其他孵育时间与对照间无显著性差异（图2）。

2.3 SA孵育对早黑宝葡萄叶片总黄烷-3-醇含量的影响

在0～3 h内，相比对照，总黄烷-3-醇含量在SA孵育3 h时出现高峰。总黄烷-3-醇含量在1、3 h时极显著高于对照，72、240 h时显著低于对照，192 h时极显著低于对照，其他孵育时间与对照间无显著性差异（图3）。

2.4 SA孵育对早黑宝葡萄叶片儿茶素含量的影响

SA孵育葡萄新梢，儿茶素含量在1 h达到最高峰，儿茶素含量在1、120 h时极显著高于对照，较对照分别提高了1.55、1.75倍，24 h时显著高于对照，其他孵育时间与对照间无显著性差异（图4）。

2.5 SA孵育对早黑宝葡萄叶片表棓儿茶素含量的影响

SA孵育葡萄新梢，表棓儿茶素含量在24 h出现最高峰，表棓儿茶素含量在3、6、24、72、120、240 h时均极显著高于对照，较对照分别提高了7.15、10.03、1.50、7.59、12.78、6.43倍，1 h时显著高于对照，其他孵育时间与对照间无显著性差异（图5）。

2.6 SA孵育对早黑宝葡萄叶片表儿茶素含量的影响

SA孵育葡萄新梢，表儿茶素含量在12 h出现最高峰，表儿茶素含量在12 h时极显著高于对照，较对照提高5.16倍，6、24、72 h时显著高于对照，其他孵育时间与对照间无显著性差异（图6）。

3 讨论

本研究结果表明，早黑宝葡萄新梢叶片在离体条件下经0.5 mmol/L SA孵育，在0～6 h内，叶片总酚、总类黄酮、总黄烷-3-醇含量高于对照，在短时间内外源水杨酸可促进植物多酚物质积累，这与前人研究结果[18，25]一致。MINA等[26]在切除的倒刺菠菜叶柄中，用一定范围的水杨酸浓度（0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L）饲喂，结果显示，0.5 mmol/L饲喂8～10 d是最理想的方法。本研究发现，0.5 mmol/L SA孵育1 h是最佳方式，与MIN等[26]的研究结果不同，原因可能是孵育材料、外界环境条件的不同导致最佳孵育时间存在差异。随SA孵育时间的增长，葡萄叶片的总酚含量、总类黄酮含量、总黄烷-3醇含量下降，这可能与离体葡萄叶片自身的生长代谢有关。

朱越[27]在葡萄叶片发育过程中检测到（+）-儿茶素、（-）-表棓儿茶素、（-）-表儿茶素、（-）-表儿茶素没食子酸酯4种黄烷-3-醇单体。在叶片发育的所有阶段，叶片原花青素延伸亚单位组成都是相似的，表儿茶素是主要的亚单位，其次是表棓儿茶素，还有少量的儿茶素和表儿茶素没食子酸酯，本试验测定的葡萄叶片的黄烷-3-醇含量为0.26～1.20 mg/g，与KHAN等[22]和DOWNEY等[28]的结果相似。本试验发现，早黑宝葡萄新鲜叶片中（+）-儿茶素含量最高，（-）-表棓儿茶素含量次之，（-）-表儿茶素含量最少，这与DANI等[29]的研究结果类似。而酯化的黄烷-3-醇如（-）-表儿茶素没食子酸酯与低聚原花青素在茶树叶片中积累到非常高的水平[30]，但在葡萄叶片中含量极小，几乎检测不到，可能是（-）-表儿茶素没食子酸酯含量过小而未达到仪器检测限。

蒸馏水孵育葡萄新梢，儿茶素含量基本处于上下波动状态，表棓儿茶素和表儿茶素含量大致表现先升高后下降，表棓儿茶素含量在24 h出现最高峰，而表儿茶素含量在120 h出现最高峰，可能是随蒸馏水孵育时间的加长，葡萄叶片中的无色花青素合成儿茶素，儿茶素合成原花青素2个阶段均趋于相对平稳状态，而部分表棓儿茶素先于表儿茶素合成原花青素，在后期表棓儿茶素含量先于表儿茶素下降，直至240 h后含量趋于平稳。

前人研究表明，花青素还原酶（Anthocyanidin reductase，ANR）和无色花青素还原酶（Leucoanthocyanidin reductase，LAR）对黄烷-3-醇的合成具有特异性，ANR催化花青素转化为2，3-顺式-黄烷-3-醇，即-（-）表儿茶素[31]、（-）-表棓儿茶素和（-）-表儿茶素-3-O-没食子酸酯，而LAR催化无色花青素转化为2，3-反式-黄烷-3-醇，如（+）-儿茶素[32-33]。本试验发现，0.5 mmol/L SA孵育0～240 h内，葡萄叶片儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素含量基本高于对照，其原因可能是，SA激活了葡萄叶片ANR、LAR活性，从而提高了葡萄叶片儿茶素、表棓儿茶素及表儿茶素含量。在120 h下，SA对葡萄叶片儿茶素、表棓儿茶素含量提高最明显，且SA对表棓儿茶素含量的影响最大，对儿茶素含量的影响次之，表明SA对合成表棓儿茶素的促进作用大于对合成儿茶素的促进作用。

4 结论

外源0.5 mmol/L SA对葡萄叶片多酚类物质积累具有促进作用，SA处理短时间内可以促进葡萄叶片总酚、总类黄酮、总黄烷-3-醇物质的积累。0.5 mmol/L SA促进葡萄叶片黄烷-3-醇单体积累，特别是对儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素含量积累具有明显的促进作用，且SA对合成表棓儿茶素的促进作用大于对合成儿茶素的促进作用。