颗粒细胞对卵母细胞成熟和排卵影响研究进展

范冰峰，赵向远，韩玉萍，李文，李晓霞，许保增

（中国农业科学院特产研究所，特种经济动物分子生物学重点实验室，吉林 长春 130112）

卵母细胞成熟和排卵过程对于雌性动物的生殖生理十分重要，颗粒细胞利用多种细胞之间的相互作用和信号调节，将这2 个过程紧密联系起来[1]。在雌性哺乳动物中，卵母细胞被单层扁平的颗粒细胞包裹，卵母细胞停滞在第一次减数分裂前期的双线期。随着卵泡的不断发育，颗粒细胞由扁平状变为柱状，由单层变为多层。在卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）的作用下，卵泡腔形成，卵泡成熟。在黄体生成素（luteinizing hormone，LH）峰作用下，卵丘扩展、卵母细胞减数分裂恢复、卵泡破裂，以实现排卵。颗粒细胞依据解剖学结构分为壁层颗粒细胞（mural granulose cell，MGC）和卵丘细胞（cumulus cell，CC）[2]，壁层颗粒细胞参与细胞分化和信号转导[3]，卵丘细胞参与细胞增殖和代谢[4]。卵丘细胞 通过缝隙连接（gap junction，GJ）与卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COCs）[5]，研究卵母细胞和颗粒细胞之间的直接交流或旁分泌作用对排卵过程的影响，有助于人们理解生殖细胞发育的机理。本文综述了颗粒细胞对卵母细胞成熟的影响、颗粒细胞与卵母细胞的互作对排卵过程的影响以及卵丘扩展对卵母细胞成熟和排卵的影响，以期为哺乳动物卵母细胞体外成熟体系的建立，以及排卵机理的研究提供新的思路。

1 颗粒细胞对卵母细胞成熟的影响

1.1 颗粒细胞为卵母细胞提供能量

卵母细胞中的葡萄糖不能通过糖酵解直接分解供能，卵丘细胞的胞质突起穿过透明带与卵母细胞直接接触，而末端通过缝隙链接卵母细胞质膜，为卵母细胞提供营养代谢物质[6]。卵母细胞通过缝隙链接获得氨基酸、核苷酸、谷胱甘肽和糖代谢产物[7]等物质，为卵母细胞提供能量[8]。Herrick 等[9]研究发现，山羊COCs的糖酵解速率是氧化磷酸化速率的3 倍，在卵母细胞成熟过程中葡萄糖是COCs 的关键能量代谢物，糖酵解是关键的能量代谢途径。由于卵母细胞磷酸果糖激酶和乳酸脱氢酶活性低，卵母细胞的糖酵解效率仅为COCs 的50%，葡萄糖主要由卵丘细胞糖酵解产生丙酮酸和乳酸，转移至卵母细胞线粒体中，为其分解供能[4]。卵母细胞又通过上调卵丘细胞中糖酵解基因的表达来保证其丙酮酸的供应[10]。通过对醛糖还原酶和山梨醇脱氢酶在卵巢颗粒细胞和卵母细胞中的表达定位分析，表明葡萄糖在颗粒细胞中还原脱氢形成的山梨醇，会被卵母细胞间接合成果糖供能[11]。卵母细胞成熟主要由颗粒细胞提供能量物质。

1.2 颗粒细胞维持卵母细胞减数分裂阻滞

在生长卵泡中，颗粒细胞分泌类固醇和肽类激素来调节发情周期，卵母细胞积累母体所需的mRNA和蛋白质，为卵母细胞减数分裂、成熟和胚胎发育做准备。腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和环磷鸟嘌呤核苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）这些信号分子不仅可以为卵母细胞提供能量，同时对于恢复卵母细胞减数分裂阻滞十分重要。在卵母细胞周期性调节过程中，成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）直接或间接地调节 cAMP-PKA 信号通路。高水平的cAMP 通过激活卵丘细胞中腺苷酸环化酶，维持细胞周期蛋白的MPF 处于无活性状态，使其无法恢复减数分裂[12]。cGMP 是由跨膜鸟苷酸环化酶利钠肽受体2（natriuretic Peptide Receptor 2，NPR 2）产生的，它存在于颗粒细胞中，但不存在于卵母细胞中，在维持减数分裂停滞起着重要作用。排卵前期，处于颗粒细胞的cGMP 通过缝隙链接扩散到卵母细胞，使cGMP 的拮抗剂cAMP 磷酸二酯酶失活，从而导致高水平的 cAMP 无法降解，抑制减数分裂进程[13]。即使是在成熟的最后几小时去除卵丘细胞层，卵母细胞成熟并发育成正常胚胎的能力也会受到严重损害[14]。

1.3 颗粒细胞促进卵母细胞减数分裂恢复

卵母细胞减数分裂的恢复需要颗粒细胞的诱导，主要有3 个因素：①LH 峰诱导卵丘细胞丝裂原活化蛋白激酶3/1（MAPK 3/1）活化[15]，同时降低壁层颗粒细胞中 C 型利钠肽（C-type natriuretic peptide，NPCC）的浓度，导致成熟抑制因子 cAMP 水解，减数分裂恢复；②缝隙连接对减数分裂的恢复作用，相关研究发现当小鼠卵母细胞缝隙链接被破坏时，阻滞减数分裂的信号则无法进入卵母细胞，减数分裂恢复[16]；③LH受体（LH receptor，LHR）是G 蛋白偶联受体家族成员，在卵巢中介导LH 峰对细胞的作用。LHR 在卵母细胞和卵丘细胞中几乎不表达，而在颗粒细胞大量表达，所以颗粒细胞在传递LH 排卵信号中起着桥梁作用[8]。收集COC并进行体外培养时，卵母细胞发展到具有受精和发育能力的MII 期，在对裸卵体外培养时，卵母细胞成熟率和受精率均低于COC 的水平，这表明颗粒细胞对于促进卵母细胞减数分裂的恢复起重要作用[17]。

2 颗粒细胞与卵母细胞的互作对排卵过程的影响

2.1 颗粒细胞与卵母细胞分泌的信号因子和代谢产物对排卵的影响

卵母细胞通过分泌骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP 15）和生长分化因子 9（growth differentiation factor 9，GDF 9）调节卵丘细胞基因的表达。这些细胞因子通过抑制编码LHR 的基因，使得排卵前卵丘细胞表达的 LHR 蛋白水平降低[18]，来抑制促性腺激素诱导孕酮的合成，从而调控卵泡的发育和排卵。同时，GDF 9 和BMP 15 激活了卵丘特异性代谢的关键基因表达，如糖酵解酶[19]和胆固醇生物合成酶[20]，它们是卵母细胞活力和功能的重要介质。GDF 9 和BMP 15 通过TGF- 超家族受体发出信号激活细胞内 Smads 途径[21]。Pangas 等[22]通过敲除 Smad 4 的小鼠研究发现，颗粒细胞黄体化提前，孕酮水平上升，最终导致卵巢功能早衰。从COCs 中去除卵母细胞或用GDF 9/BMP 15 的拮抗剂处理会导致颗粒细胞异常诱导和卵丘特异性基因表达的丢失[23]。Qin 等[24]通过建立BMP 15 基因敲除模型猪，转录组分析显示BMP 15 影响颗粒细胞和卵母细胞发育，包括抑制细胞的增殖分化和卵泡刺激素受体表达，导致雌二醇产生的减少，异常卵泡数量增加，有腔卵泡异常增大，导致排卵障碍和生殖激素紊乱。

Yu 等[25]建立了特异性敲除DNA 损伤结合蛋白1（damage specific DNA binding protein 1，DDB 1）和DDB 1-CUL 4 相关因子 1（DDB1-CUL 4 associated factor 1，DCAF 1）的小鼠动物模型，发现卵母细胞内的DDB 1/DCAF 1 是卵丘扩张和排卵相关基因表达所必需的。其潜在的机制是DDB 1/DCAF 1 缺失损害了编码卵母细胞的旁分泌因子GDF 9、BMP 15 和成纤维细胞生长因子 8（fibroblast growth factor 8，FGF 8）基因的表达，未能激活周围卵丘细胞中的 TGF- 信号，影响了COCs 对LH 峰排卵信号的反馈，进而导致排卵率显著下降。Andreu-Vieyra 等[26]研究发现，若卵母细胞特异性缺失MⅡ组蛋白甲基转移酶，导致转录沉默，卵泡破裂受阻，排卵过程被阻断，因此通过卵母细胞与颗粒细胞之间的信号交流情况，可以判断成熟的卵母细胞能否顺利排出。干细胞因子（stem cell factor，SCF）是一种表达于颗粒细胞、膜细胞和基质细胞的细胞因子，通过与卵母细胞上的酪氨酸激酶受体C-Kit结合，激活磷脂酰肌醇3 磷酸信号通路，促进了卵母细胞因子的产生，调节卵泡发育并触发排卵[27]。Salmassi等[28]通过研究卵泡成熟、排卵、着床和妊娠过程中血清SCF 水平在月经周期中的变化，发现SCF可能是卵泡成熟的一个潜在的标志物，血清中SCF 水平反映了卵泡成熟程度并有助于预测卵母细胞的成熟度。Tan等[29]研究发现，颗粒细胞中的卵母细胞水平与卵母细胞的发育潜能呈正相关，随着SCF 的水平提高，卵泡的排卵能力有显著提高。

Noch 信号是一条进化保守的途径，可以调节细胞的增殖、分化和凋亡。Notch 信号通路在卵泡发育中起关键作用，c-Myc 是 Notch 信号的直接靶基因，Notch信号通过诱导c-Myc 的表达来调控颗粒细胞的增殖。Zhang 等[30]利用 Notch 通路抑制剂 L-685、458 和DAPT 处理体外培养的原始卵泡后，卵泡发育完全停滞，原因是c-Myc 的表达水平降低，抑制了颗粒细胞的增殖，导致卵母细胞变性、胞浆浓缩，最终引起卵泡发育不全。颗粒细胞和卵母细胞之间的相互作用对于卵泡的正常发育、排卵非常重要。

2.2 颗粒细胞与卵母细胞间重要的通讯结构对排卵的影响

Gershon 等[31]研究发现，卵丘细胞与卵母细胞之间形成重要通讯结构——缝隙链接参与了卵泡生长、卵子发育和黄体形成的过程。其中，连接蛋白37（connexin-37，Cx-37）和连接蛋白 43（Connexin-43，Cx-43）已被证实在调节卵泡生长和卵母细胞成熟中起着关键作用[32]。Cx-37 是连接卵母细胞和卵丘细胞之间的连接蛋白，被敲除Cx-37 的小鼠，其卵母细胞和卵丘之间细胞偶联被破坏，细胞核成熟受阻，无法正常排卵[33]。Cx-43 是连接卵丘细胞和壁层颗粒细胞之间的连接蛋白，在大鼠卵巢中卵泡的发育和成熟过程中均受到Cx-43 的周期性调节，排卵前 Cx-43 在卵丘细胞和壁层颗粒细胞中大量合成，排卵后Cx-43 的表达被迅速抑制[34]。值得注意的是，存在于卵巢中的TGF- 超家族的亚型成员 TGF- 1 与 Cx-43 之间，在周期性表达的时空上有着一致性。TGF- 1 通过在颗粒细胞中调节Cx-43 的表达，促进细胞间通讯，从而促进排卵[35]。

2.3 LH 峰对颗粒细胞相关信号通路的作用

LH 峰通过激活颗粒细胞下游信号通路，诱导卵母细胞生长后期细胞质和细胞核成熟、排卵以及排卵后黄体的形成[36]。LH 与成熟卵泡壁层颗粒细胞上的经典G 蛋白偶联受体LHR 结合，介导激活细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases 1/2，Erk 1/2）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）和蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）[37]等信号通路。这些不同的信号级联是卵母细胞成熟和排卵过程中重要的信号通路。

LH 峰激活ERK 1/2 被认为是调控卵母细胞减数分裂的恢复、卵丘扩展和排卵的关键通路[38]。Fan 等[39]发现，被敲除Erk 1/2 的小鼠，其卵丘扩展受阻，卵泡虽然可破裂排卵，但不能形成黄体，进而导致雌鼠不育。HSIEH等[40]对排卵前后颗粒细胞中提取的RNA 进行微阵列分析，观察结果显示，LH 诱导小鼠颗粒细胞类EGF 生长因子双调蛋白（amphiregulin，AR）、上皮调节蛋白（epiregulin，EPI）和 细胞素（beta-cellulin，BTC），它们作用于壁层颗粒细胞和卵丘细胞胞外区EGF 受体（EGF receptor，EGFR），使其细胞内特定酪氨酸残基磷酸化，从而激活ErK 1/2 通路和PKC 的信号通路。研究表明，给小鼠注射 LH 类似物 hCG，可诱导 AR、EPI 和BTC 表达量升高[41]，从而诱导颗粒细胞分泌类EGF 生长因子，使卵丘细胞的 EGFR 活化，促使卵丘扩张和卵母细胞的成熟[42]。EGF 信号通路激活启动卵丘扩展，EGF 引起卵丘细胞孕酮水平的上升，这可能在受精过程中起到精子趋化因子的作用，这一系列翻译后修饰对卵母细胞核成熟起关键作用[43]。

长期以来，孕酮一直被认为是调节女性生育能力、维持妊娠的重要激素，孕酮对排卵也具有重要作用[44]。LH 峰激增可迅速诱导孕酮特异性受体（progesterone receptor，PR）的 mRNA 表达，这种选择性诱导发生在排卵前卵泡的壁层颗粒细胞中[45]。LH 峰通过 PKA/cAMP 介导的Erk 1/2 信号诱导PR，向超排大鼠注射含有hCG 的抗孕酮血清可抑制排卵[41]。在LH 峰刺激下，壁层颗粒细胞中会诱导ADAMTS-1 和Cathepsin L 两种蛋白酶的表达，并启动对卵泡破裂相关下游靶点的转录。ADAMTS-1 蛋白酶结构域介导了细胞降解和卵泡壁溶解[46]，Cathepsin L 蛋白酶作用于细胞外基质，用以维持卵泡壁的完整性[47]。PR 的俩个异构体PRA 和 PRB 是同一个转录本翻译而来，在 LH 诱导下，PRA 是主要的翻译产物，对PR基因敲除的雌性小鼠即使在外源激素下也不能排卵，并且完全不育[44]。因此，LH 诱导颗粒细胞和卵丘细胞中的孕酮依赖性通路，从而介导了排卵过程。

3 卵丘扩展对卵母细胞成熟和排卵的影响

在LH 峰作用下，卵丘通过产生蛋白聚糖和糖蛋白，并在卵丘层周围形成细胞外基质（extracellular matrix，ECM），称为卵丘扩展。扩展的卵丘与卵母细胞形成紧密的复合体，可保护卵母细胞免受机械压力，避免卵泡或输卵管中的蛋白水解酶的降解，通过促进输卵管壶腹部捕获卵母细胞并引导卵母细胞转运至受精部位[48]。卵丘扩展是通过颗粒细胞分泌类 EGF 生长因子[41]和 COCS 旁分泌前列腺素（prostaglandin，PG）的信号激活的[49]。

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是卵丘扩展的主要结构骨架，透明质酸合酶 2（hyaluronan synthase 2，Has 2）通过诱导透明质酸结合蛋白Tnfaip 6、I I 和Ptx 3 等下游基因，促进细胞外基质的合成。Tnfaip 6 或I I 的缺失也会导致卵丘产生HA 不稳定，使得卵丘在体内或体外试验均无法正常扩展[50]。I I 与HA 结合后导致排卵效率大幅度下降，排卵率和受精率下降近近50%[51]。Tnfaip 6 敲除小鼠和Ptx 3 敲除小鼠也表现出明显的排卵障碍[52]。LH 峰后，前列腺素内过氧化物合酶 2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，Ptgs 2）在颗粒细胞中迅速诱导，促进排卵[53]。Ptgs 2 基因的敲除导致卵丘扩展受阻，排卵异常小鼠不育[54]。颗粒细胞主要产生前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE 2），它是卵巢中的花生四烯酸酯代谢产物，PGE 2 通过作用于其特异性受体 EP 2 发挥作用。小鼠卵丘细胞表达的EP 2功能缺失时，将会导致排卵和受精功能受损[55-56]。PG 的相关基因（如 Ptgs 2 和 Ptgs 4）、cAMP 信号相关基因（如Crem、Nmu 和Rgs 10）以及EGF 家族相关基因（如Areg、Ereg 和Btc）的基因表达，都起着启动并放大LH 峰的作用。

卵丘扩展在促进排卵的同时也会协助卵母细胞成熟。卵丘产生的蛋白聚糖通过与EGF 受体信号相结合，诱导卵丘卵母细胞复合体的活化[57]。一系列研究表明，卵丘的扩展依赖于Has 2、Ptx 3、Ptgs 2 和Tnfaip 6[58-60]转录水平的增加，与卵母细胞质量呈正相关。在卵丘细胞中表达的透明质酸受体CD 44 的mRNA 表达量与卵丘扩展程度也呈现正相关[61]。透明质酸及其受体CD 44 的调控系统通过激活一些信号分子，诱导Cx-43 的酪氨酸磷酸化，卵母细胞的生发泡破裂，触发排卵[62]。透明质酸及其受体CD 44 的调控系统通过影响卵母细胞与颗粒细胞之间的信号交流，调节卵母细胞减数分裂恢复和后续排卵的过程[63]。

4 结语与展望

颗粒细胞诱导卵母细胞减数分裂的恢复并为其提供能量物质，卵母细胞又通过信号分子促进颗粒细胞表达，它们之间的双向调节促进卵泡成熟和排卵。近年来，随着辅助生殖技术和克隆技术的研究不断深入，越来越多的学者认识到颗粒细胞是影响雌性动物生殖能力的一个关键因素。通过探索颗粒细胞和卵母细胞的双向调节，将卵母细胞成熟和排卵的相关通路联系起来，可为人们进一步揭示生殖细胞发育机制建立卵母细胞体外成熟体系以及临床不孕不育症的预防和治疗开辟新思路。