改良法分光光度计测定食品中亚硝酸钠含量

平秋婷

(广东省科学院生物工程研究所，广州 510316)

亚硝酸钠俗称亚硝酸盐，是一种由亚硝酸根离子与钠离子合成的无机盐，主要应用于食品中，具有护色剂功能，保障食物的颜色鲜艳，虽然这种食品添加剂具有一定的优点，但是其与食品共同进入人体会与人体中的蛋白质等有机物质产生反应生成致癌物质，甚至会将人体内的正常血红蛋白氧化为缺乏输氧功能的高铁血红蛋白，为食品消费者带来巨大的安全隐患。为此，如何快速、精准地测定食品中亚硝酸钠含量已经成为人们的重要研究课题。

文献[1]中采用色谱法对食品中的亚硝酸钠含量进行测定，对食品中的亚硝酸盐类物质进行离子色谱、气相色谱和高效液相色谱法的含量测定；文献[2]中应用电化学分析法，将食品物质溶入到液体化学电池中，通过判断电解池中的电位差或电流强度来判定食品中亚硝酸钠含量。

本文主要研究应用改良法分光光度计测定食物中的亚硝酸钠含量，并依据GB 5009.33-2010《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中第二法分光光度法(盐酸萘乙二胺法)整理本文方法下的相关实验数据，验证本文方法的快速有效性。

1 材料与方法

1.1 材料

分光光度计、电子天平、量筒、烧杯、玻璃棒、漏斗、擦镜纸、肉类食品、酒精灯、温度计、氨基苯磺酸溶液、盐酸萘乙二胺溶液、重铬酸钾、橘红G、硫酸、蒸馏水、重氮盐等。

1.2 方法

本文应用肉类食品作为测定方法的样品，将肉类食品进行蛋白质剔除与脂肪剔除，在酸性环境中投入亚硝酸钠，亚硝酸钠与酸性环境中物质融合后再次向酸性环境中加入重氮盐与盐酸萘乙二胺，生成一种能够被分光光度计识别的623 mm波长的可吸收光波[3-4]。

方法的实现过程：

(1)需要将肉类食品打磨成肉泥状物质，利用电子天平精准提取10 g样品；

(2)再将样品置于50 mL的烧杯中，用玻璃棒持续搅拌2 min左右，向烧杯内加入饱和状态下的蒸馏水；

(3)再次用玻璃棒搅拌2 min左右，应用酒精灯对烧杯进行加热，当烧杯中样品温度达到80 ℃停止加热，将烧杯中样品转入量筒中并进行摇匀；

(4)再次将量筒中的样品进行水浴加热至70 ℃，最后用冷水浴的方式使样品温度降低到常温，获取肉类食品的待测定食品提取液。

由于只经过加热处理后的待测定样品中会存在一些易发生化学反应的其他有机物质，所以本文将在常温化的样品提取液中加入3 mL亚铁氰化钾溶液，再加入50 mL蒸馏水进行样品定容并摇匀，使样品提取液静置止1 h，容易产生化学变化或干扰分光光度计进行测定的物质沉淀在量筒底部，溶液上层澄清的液体主要为蒸馏水以及其他滤液，不包含本次实验测定的亚硝酸钠物质与肉类食品含量，样品提取与净化流程图见图1。

图1 样品提取与净化流程图Fig.1 The flow chart of sample extraction and purification

实验中还制定亚硝酸钠的标准溶液，用电子天平精准量取0.2 g亚硝酸钠，在干燥常温的环境中制取亚硝酸钠标准溶液，为了防止亚硝酸钠标准溶液在空气中氧化而干扰分光光度计对亚硝酸钠的测定结果，需要在实验进行过程中对亚硝酸钠标准溶液进行现用现配[5-6]。将配制好的亚硝酸钠标准溶液放置在经过改良法改良后的分光光度计比色管中，并在比色管中添加一定量的氨基苯磺酸溶液，待比色管中溶液静置10 min左右，管内会产生少量的重氮盐，为了防止重氮盐对亚硝酸钠含量的干扰，再向比色管中添加盐酸萘乙二胺溶液定容，分解比色管中的重氮盐，此时比色管中需要具体加入的相关溶剂见表1。

表1比色管中需要具体加入的相关溶剂量Table 1 The specific solvent amount added into the colorimetric tube mL

(1)应用分光光度计吸取比色管中的样品溶液与亚硝酸钠标准溶液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，并分别将不同浓度的样品溶液与标准溶液放置于50 mL容量的量筒中；

(2)再分别向每个量筒中加入2 mL氨基苯磺酸试剂，与样品溶液和标准溶液完全混合，静置5～6 min后再向各个量筒中加入盐酸萘乙二胺溶液；

(3)将量筒内的溶液摇匀，再静置5 min左右，用比色杯对不同浓度的样品溶液与标准溶液进行不同波长的测定吸取，并绘制标准曲线在分光光度计中体现。

不同浓度下的分光光度计曲线测定图见图2。

图2 不同浓度下的分光光度计曲线测定图

1.3 改良法分光光度计性能测试

本文应用改良法的分光光度计对食品中亚硝酸钠含量进行测定，具有一定的自动化性能，相对于普通的分光光度计更加智能化，在实验测定前需要对改良法分光光度计进行性能测定，确定分光光度计对亚硝酸钠的波长识别能力、杂光识别能力、散光吸收能力有着良好的稳定性[7-9]。

根据国家市场监督管理总局对分光光度计相关仪器的参数标准，仪器设备对杂散光的吸收精准度不得小于2.3；吸光度的范围在标准值范围的±5%内，且最大的吸光程度不得大于2；分光光度计的运行稳定性变化不得超过标准值的0.02；分光光度计的精准程度见表2。

表2 分光光度计吸光精准程度表Table 2 Spectrophotometer absorption precision degree table

首先进行杂散光的测试，由于分光光度计在340 nm紫外线环境中的感光能力较弱，相对于其他测定设备信噪比较低，导致杂散光的干扰对测定结果有着较大的影响，测定时需要应用浓度达到100 mL/L的亚硝酸钠标准液作为测试样本，用蒸馏水作为该测试实验的对比因变量，获取蒸馏水的杂散光测定结果为4.02，符合标准要求[10]。

再测试分光光度计吸光度准确性，分别应用浓度为50，60 mL/L的重铬酸钾溶液与亚硝酸钠溶液进行吸光测定，在分光光度计中分别进行3次重复性测试，计算3次测试平均值来衡量改良法分光光度计的吸光准确度。吸光度准确度测量数据见表3。

表3吸光度准确度测量数据Table 3 Absorbance accuracy measurement data

最后对分光光度计的吸光度范围进行测试，根据改良法分光光度计的标准吸光度阈值可知，分光光度计能够确定食品中亚硝酸钠含量的可测试光波长在250～350 nm之间。

为了能够保障分光光度计在一定范围内的波长进行稳定测试，本文将按照食品中亚硝酸钠原液含量的配比进行重新配制分光光度计可识别色素，色素原液的配比原料见表4。

表4 色素原液的配比原料Table 4 The raw materials' ratios of pigment stock solution

分光光度计在食品中识别出的亚硝酸钠测定含量的整体结果受到吸光度的范围性影响，而本文按照吸光度中的两种重要组成溶质的不同比例来计算吸光度的间接表现数据。

重铬酸钾溶质和橘红G在分光光度计中表现的吸光度测试数据见表5和表6。

表5 重铬酸钾溶质在分光光度计中的吸光度测试数据Table 5 The testing data of absorbance of potassium dichromate solute in spectrophotometer

表6 橘红G溶质在分光光度计中的吸光度测试数据Table 6 The testing data of absorbance of orange G solute in spectrophotometer

续 表

由表5和表6可知，两种溶质在分光光度计中对亚硝酸钠吸光准确度的范围影响程度小于10%，达到了实验进行的基本要求。

2 结果与分析

应用改良法分光光度计在肉类食品中测定的亚硝酸钠波长为534 nm，分别在不同浓度溶液与标准液中进行标准度的测试与吸光度等因素的测定，根据标准样本中测定数据与样品中亚硝酸钠的测定数据共同获取曲线公式，从而计算得到亚硝酸钠在食品中的精准数据。改良法分光光度计中测量的亚硝酸钠制备溶液参数见表7。

设定亚硝酸钠质量在分光光度计中的工作曲线为横坐标值，吸光度在分光光度计工作曲线中为纵坐标值，亚硝酸钠在分光光度计中的标准工作曲线图见图3。

改良法下的分光光度计工作曲线计算公式为：

式中：X代表食品中亚硝酸钠的含量，mg/kg；A代表实验测量样品中亚硝酸钠在分光光度计中的质量，μg；m代表食品中的亚硝酸钠质量，g；V代表样品溶液的体积，mL；V0代表分光光度计中的样品总体积。应用公式对改良法下的分光光度计中样品溶液亚硝酸钠含量进行测定，结果见表8。

实验中两次的含量测定结果分别为3.23 g与5.36 g，两次的亚硝酸钠含量测定均具有独立性，平均值与相应的具体精准数据活动范围在10%内，符合标准的分光光度计计划结果，根据GB 2760-2011《食品添加剂使用卫生标准》中亚硝酸钠的食品添加剂注意事项中可知，大多数应用亚硝酸钠添加剂的食品中会有大量的残留，当肉类食品中亚硝酸钠的残留量小于30 mg/kg时则证明实验中的亚硝酸钠含量在合格的范围内，因此能够对食品中亚硝酸钠含量的精准测定关乎食品的质量是否合格。

本实验先应用文献[1]中的色谱对比法进行食品亚硝酸钠含量测定，应用电子秤称取n质量的标准样品，样品中引用的相对标准的质量评定方法。根据量筒中样品的标准测定参数确定色谱对比方法中容易引起实验结果变化的原因，对样品进行定容与实验环境的改善，在标准环境下温度的变化范围在±5 ℃内，样品在标准溶剂中的膨胀系数确定为2.36×10-3/℃，假设亚硝酸钠在量筒中的分布状态均匀，进行色谱对比获取亚硝酸钠含量数据。再用电化学分析法，将含有亚硝酸钠的食品用电子秤称取相同质量的样品，应用电解析的方式获取食品中亚硝酸钠的含量，再用电子秤称取经过电解后的亚硝酸盐，利用质量的差值获取亚硝酸钠的含量数据。对3种不同的测定方法进行对比，测定食品中亚硝酸钠的精准程度结果，见图3。

图3 测定食品中亚硝酸钠的精准程度结果Fig.3 The determination results of the accuracy of sodium nitrite in food

由图3可知，本文应用的改良法下的分光光度计对食品中亚硝酸钠含量测定精准度更高。改良法下分光光度计中添加氨基苯磺酸溶液与盐酸萘乙二胺等化学物质提高亚硝酸钠在分光光度计中的测定有效量。

3 结束语

本文根据国家标准GB 5009.33-2010《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度计进行改良后的测定方法进行食品中亚硝酸钠含量的测定，具有操作简单、测定精准程度高、干扰因素少、测定结果体现快等优势，通过可见光的形式即可表现出亚硝酸钠含量。测定实验中首先应用6组样品作为分光光度计的测定含量的对比组，取几组样品的测定平均值为最终的测量结果依据。根据实验的最终数据可知，文献[1]、文献[2]中应用的方法对亚硝酸钠含量测定精准度均小于本文方法的测定精准度。