孵化期LED绿光照射对坝上长尾鸡胚胎期肌纤维发育的影响

郝文文，张 贝，任一帆，孟 婕，巩 静，杨 晴，耿立英，张传生，李祥龙

(河北科技师范学院河北省特色动物种质资源挖掘与创新重点实验室，河北 秦皇岛，066600)

禽类是光敏性动物，具有特殊的光受体通路[1]。孵化期间对禽类种蛋进行光照调控可促进胚胎的生长发育、提高免疫力及促进孵化后生长期的生长速率及抗压抗应激能力[2]。因此，科学合理地利用光色信息对于改善禽蛋孵化性能、提高家禽生产性能具有重要意义。

研究表明，光谱对禽类胚胎发育的影响存在区别，其中单色绿光对禽类胚胎发育和肌肉生长的促进作用显著优于其他光色[3]。肉鸡胚胎期给予单色绿光照射能增强代谢，促进鸡胚骨骼肌卫星细胞的增殖与分化，显著增加胚胎后期至出雏后的体质量和胸肌比例，提高出雏率和健雏率[4，5]。进一步的机制研究表明，单色绿光能促进鸡胚褪黑激素分泌、肝脏的发育和IGF-1分泌[4,6]，显著提高胚胎后期及生长期肉仔鸡血清GH和IGF-1含量[3,7]，通过MyoD调控途径促进胚胎骨骼肌卫星细胞的增殖分化，进而实现胚胎肌肉显著发育[3]。然而，因受遗传、发育等因素影响，禽类蛋壳的物理化学特性不同，胚胎能接收到绿光的照度也不同。因此，对于不同品种种蛋的最优光照条件均有待研究。本次试验以坝上长尾鸡为研究对象，探索不同照度的单色绿光照射对胚胎期肌肉发育的影响，为坝上长尾种蛋孵化科学合理利用人工光照提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及孵化条件

本次研究中使用的坝上长尾鸡种蛋引自张家口市绿色田园禽业科技有限公司，160枚种蛋质量为(52.25±3)g，种蛋进行消毒、编号、称质量(入孵蛋质量)，孵化器(NLF-320型微电脑全自动孵化器，山东农科孵化设备有限公司，山东德州)规格为长110 cm×宽100 cm×高90 cm。每个孵化器至少提前3个工作日进行运行，孵化箱用温度计和湿度计进行实时校准和监测。孵化条件：1～6 d孵化温度为38.0 ℃，湿度为60%；7～18 d孵化温度为37.8 ℃，湿度为55%；孵化后期温度为37.2 ℃，湿度为65%。

1.2 实验方案

设置3个不同照度LED绿光对坝上长尾鸡种蛋进行照射，在种蛋孵化的10～18 d给予连续光照(12 h光照-12 h黑暗)。光照度分别为弱光组30～80 lx，中光组90～140 lx，强光组150～200 lx；对照组保持黑暗。在12，14，16，18，20胚龄时每组收集3个种蛋，剥壳后取鸡胚的胸肌和腿肌(腓肠肌)用1.44 mol/L的甲醛溶液进行固定24 h，制作石蜡切片。

1.3 主要试剂及仪器

试剂分别为：1.44 mol/L的甲醛溶液(购自石家庄丰悦科技有限公司)，二甲苯(购自泰安正大化工有限公司)，石蜡(购自克拉玛尔)，苏木素染液(购自石家庄丰悦科技有限公司)，伊红染液(购自碧云天生物技术研究所)，盐酸、中性胶(购自石家庄丰悦科技有限公司)，各级乙醇(国产分析纯)。

仪器主要有：微电脑全自动孵化控制器(NLF-320型，山东农科孵化设备有限公司)、系统生物显微镜(OLYMPUS-BX40，奥林巴斯(中国)公司)。

1.4 石蜡切片的制作

取鸡胚的胸肌和腿肌，剪取小量肌肉块后快速用1.44 mol/L的甲醛溶液进行固定，24 h之后取出组织块，装入包埋盒；乙醇处理，室温脱水，室温下浸入二甲苯，脱色。在60 ℃石蜡下浸渍4 h后，进行包埋，冷却，对其完全脱水。每个组织块做3张连续组织切片。

1.5 切片HE染色

60 ℃烘片1 h，二甲苯脱蜡；苏木素染色2 min，水洗，分化液(盐酸酒精)分化，返蓝液(氨水)进行返蓝；伊红染色1 min，水洗；依次过不同浓度乙醇，至二甲苯(1)，二甲苯(2)(各5 min)；胶封片，常温保存。

1.6 测定与统计

将染色后的切片用显微镜进行拍照，用Olympus显微系统进行观察，每个时期选取3个胸肌或腿肌样品的切片，每张切片选取3个不同的视野，每个视野选取至少20条肌纤维，分别测量每条肌纤维平均直径(μm)和横截面的面积(μm2)。

数据统计结果分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行多重显著性差异，结果以均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 孵化期不同照度绿光照射鸡胚胎期腿肌发育的形态学比较

鸡胚12～18胚龄是成肌细胞增殖分化成肌管的重要时期。对不同照度LED绿光照射孵化下的坝上长尾鸡腿肌进行切片和染色，结果表明，弱光组的坝上长尾鸡的腿肌，在12胚龄肌纤维的轮廓比较完整，但还不是特别的清晰，此时肌肉发展处于成肌细胞增殖和分化的混合时期(图1)。14胚龄时腿肌肌纤维较小；当胚胎16胚龄时，肌纤维直径逐渐变大，轮廓清晰，肌束内游离的肌纤维逐渐变少，肌细胞融合时间逐渐减少，肌纤维数量基本固定；18胚龄时肌纤维已经基本成熟，未见有明显的未融合细胞，此时肌纤维数量也已基本确定；20胚龄时肌纤维粗细略有增加。

中光组的坝上长尾鸡腿肌，12胚龄时肌纤维轮廓不清晰，肌细胞融合不完全。14胚龄时开始呈现出较清晰的肌纤维轮廓，但仍有许多未融合的肌细胞游离于肌纤维外；到16胚龄时，未融合的细胞大量减少，肌细胞数量逐渐固定；18胚龄时，肌纤维基本成熟，肌纤维数量相对固定；20胚龄时肌纤维直径增加。

强光组的坝上长尾鸡腿肌，在12胚龄时肌肉发育未完全，仍处于肌细胞增殖和分化的混合期，肌细胞融合程度较低；14胚龄时肌细胞轮廓逐渐清晰；16胚龄时肌纤维轮廓更加清晰，肌肉基本完成增殖和分化阶段，未融合的细胞明显减少，肌纤维直径不断增大；到18胚龄时肌纤维基本成熟，未有明显未融合细胞，此时肌纤维数量基本确定。20胚龄，肌纤维直径增加缓慢。

黑暗组的坝上长尾鸡腿肌，在12胚龄时肌细胞融合不完全；14胚龄时肌纤维的轮廓开始呈现，但仍有少量肌细胞未融合。16胚龄时，未融合的肌细胞大量减少，肌纤维数量增加。到18胚龄时，肌纤维发育基本成熟。20胚龄时，肌纤维数目逐渐固定。

孵化期使用不同照度LED绿光照射，结果发现：16胚龄时，坝上长尾鸡腿肌肌纤维直径，强光组显著低于弱光组、中光组和黑暗组(P<0.05)(表1)。18胚龄时，弱光光照组和中光组坝上长尾鸡腿肌肌纤维直径显著大于强光组和黑暗组(P<0.05)。在20胚龄时，中光组坝上长尾鸡腿肌肌纤维直径最大，显著大于弱光组、强光组(P<0.05)；而弱光组腿部肌纤维直径略大于强光组，但差异不显著(P>0.05)；黑暗组的腿肌肌纤维直径最小，显著低于光照组(P<0.05)。

图1 不同照度LED绿光孵化下坝上长尾鸡胚胎腿肌横截面

表1 孵化期不同照度LED绿光对坝上长尾鸡腿肌肌纤维直径和横截面积的影响

2.2 孵化期不同照度绿光照射鸡胚胎期胸肌发育的形态学比较

不同照度LED绿光照射坝上长尾鸡胚胎胸肌肌纤维发育情况见图2。由于腿肌和胸肌在发育过程中所受到的调控通路不同，细胞分层和迁徙的具体时期也不一致，因此后期的肌纤维形成也肯定存在差异。通过对坝上长尾鸡各胚龄胸肌进行观察，发现弱光组的坝上长尾鸡的胸肌，在12胚龄时肌纤维的轮廓比较模糊。14胚龄时腿肌肌纤维较小；随着胚龄的增长，16胚龄时肌纤维直径逐渐变大，游离的肌纤维逐渐变少，肌细胞融合时间逐渐减少，肌纤维数量基本固定；18胚龄时肌纤维已经基本成熟，未见有明显的未融合细胞，此时肌纤维数量也已基本确定；20胚龄时肌纤维粗细略有增加。

图2 不同照度LED绿光孵化下坝上长尾鸡胚胎胸肌横截面

中光组的坝上长尾鸡胸肌，在12胚龄肌纤维轮廓尚不清晰；14胚龄时开始呈现出较清晰的肌纤维轮廓，但仍有许多未融合的肌细胞游离于肌纤维外；到16胚龄时肌纤维轮廓比较清晰，未融合的细胞大量减少，肌细胞数量逐渐固定；18胚龄时肌纤维数量基本固定；20胚龄胚龄时肌纤维直径增加。

强光组的坝上长尾鸡腿肌，在12胚龄时肌肉发育未完全，仍处于肌细胞增殖和分化的混合期，肌细胞融合程度较低；14胚龄时肌细胞轮廓逐渐清晰；16胚龄时肌纤维轮廓更加清晰，肌肉基本已完成增殖和分化阶段，未融合的细胞明显减少，肌纤维直径不断增大；到18胚龄时肌纤维基本成熟，未见有明显未融合细胞，此时肌纤维数量基本确定。

黑暗组的坝上长尾鸡腿肌，在12胚龄时肌细胞融合不完全；14胚龄时肌纤维的轮廓开始呈现，但仍有少量肌细胞未融合；16胚龄时，未融合的肌细胞大量减少，肌纤维数量增加；到18胚龄时肌纤维基本成熟；20胚龄时肌纤维数目逐渐固定。

比较不同照度LED绿光照射坝上长尾鸡胸肌肌纤维直径和横截面积，结果发现：18胚龄时，黑暗组坝上长尾鸡胸肌肌纤维直径最大，显著大于光照组(P<0.05)(表2)；在20胚龄时，中光组坝上长尾鸡胸肌肌纤维直径最大，显著大于弱光组(P<0.05)，黑暗组坝上长尾鸡胸肌肌纤维显著小于中光组和弱光组(P<0.05)。

表2 孵化期不同照度LED绿光对坝上长尾鸡胸肌肌纤维直径和横截面积的影响

坝上长尾鸡胸肌肌纤维横截面积在18胚龄时中光组最大，显著大于黑暗组(P<0.05)；弱光组胸肌横截面积略大于黑暗组，但差异不显著(P>0.05)；强光组胸肌横截面积显著小于黑暗组(P<0.05)。20胚龄时，中光组、弱光组坝上长尾鸡胸肌肌纤维横截面积显著大于黑暗组(P<0.05)，而强光组的胸肌横截面积显著低于黑暗组(P<0.05)。

3 讨 论

产肉性能是家禽生产主要的经济性状，肌纤维在胚胎期发育的速度与其出生后肌肉生长呈正相关。禽类的胚胎期是成肌细胞增生和肌纤维形成的关键时期[8]，在胚胎期肌纤维数量基本固定，出生后肌纤维数量基本不变，出雏后肌肉系统发育主要有两方面：一是肌纤维长度逐渐增长，二是肌纤维横截面积变大[9]。本次研究利用不同照度LED绿光灯对坝上长尾鸡胚胎期进行照射，表明适宜LED绿光照度对坝上长尾鸡胚胎期的肌纤维发育有促进作用，与以前的调查结果一致[10]。鸡胚的腿肌和胸肌是由体节发育而来的轴下肌节是形成躯干和四肢肌肉的来源[11]，虽然都是来源于单一的体节，腿肌和胸肌的发育却依赖于不同的生肌程序和发育通路。这些发育通路具有不同特点，导致腿肌和胸肌在胚胎期发育不一致[12]，鸡的胸肌肌原细胞在4胚龄才开始发育，而腿肌肌原细胞在2.5胚龄就已开始发育[13]。

禽类的眼睛和下丘脑是光的感受器，在孵化期光感受器收到光信号刺激，分泌褪黑激素增加，从而使生长激素释放激素分泌增加，生长素含量增加，导致肝脏分泌IGF-1(胰岛素样生长因子)增加，促进生长轴基因表达，骨骼肌卫星细胞分裂增加，促进肌纤维发育。有研究报道：在鸡的生长前期，绿光是通过刺激卫星细胞的增殖，进而促进肌原细胞的数量增加。本次研究中，20胚龄时绿光照射孵化下鸡胚腿肌肌纤维面积和腿肌肌纤维直径均显著大于黑暗组，而中光组(90～140 lx)最显著，这与张林等[14]在肉仔鸡孵化给予单色光间歇性刺激的研究结果一致。研究还发现，禽类腿部肌肉发育快于胸部肌肉，腿肌纤维发育不仅在融合形成上比胸肌快，而且在后期肌纤维肥大过程中也快于胸肌纤维。由研究结果推测，鸡胚发育末期，不同照度LED绿光照射对坝上长尾鸡肌肉发育存在差异，而这种差异可能是LED绿光灯照影响到肌肉发育的调控通路上。

4 结 论

坝上长尾鸡种蛋在孵化期间给予适当的LED绿光照射，可以促进鸡胚胎期肌纤维发育。其中，使用90～140 lx的LED绿光照射时坝上长尾鸡腿肌肌纤维和胸肌肌纤维发育效果最佳，而孵化期使用150～200 lx的LED绿光照射时，对坝上长尾鸡胚胎期胸肌肌纤维的发育有一定程度的抑制作用。