超高效液相色谱-串联质谱法测定食品中维生素D

王多娇　颜春荣　徐春祥

摘要 [目的]建立超高效液相色谱-串联质谱测定食品中维生素D含量的分析方法。[方法]样品经氢氧化钾-乙醇溶液皂化、正己烷萃取、浓缩后，采用Agilent XDB-C18色谱柱分离、10 mmol/L甲酸铵甲醇-水溶液等度洗脱，经电喷雾正离子多反应监测模式进行检测，内标法定量。[结果]维生素D2和D3在5～500 ng/mL線性关系良好，二者检出限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg。在各浓度水平下，二者的回收率为83.1%～105.4%，RSD为4.3%～8.7%。[结论]该方法准确性好、灵敏度高，适用于食品中维生素D的分析测定。

关键词 维生素D;食品;超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）

中图分类号 TS207.3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）22-0190-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.051

Determination of Vitamin D in Foodstuffs by UPLC-MS/MS

WANG Duo-jiao，YAN Chun-rong，XU Chun-xiang

（Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing，Jiangsu 210008）

Abstract [Objective] To establish an analytical method for the determination of vitamin D in foodstuffs by ultra-high performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry method.[Method]The sample was saponified by potassium hydroxide-ethanol solution and extracted by n-hexane， after being concentrated， the analytes were separated on Agilent XDB-C18 column， eluted by the mobile phase consisted of ammonium formate methanol solution and water and identified by ESI-MRM， meanwhile， quantitated by internal standard method. [Result]Vitamin D2 and D3 had a linear relationship between 5 and 500 ng/mL. The detection limit（LOD） was 2 μg/kg， and the limit of quantification（LOQ） was 5 μg/kg.The recoveries ranged from 83.1% to 105.4%， RSD was  4.3% - 8.7%.[Conclusion]The method has good accuracy and high sensitivity， and is suitable for the analysis and determination of vitamin D in foodstuffs.

Key words Vitamin D;Foodstuffs;Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）

作者简介 王多娇（1985—），女，江苏丰县人，高级工程师，硕士，从事食品安全研究。*通信作者，研究员级高级工程师，硕士，从事食品安全研究。

收稿日期 2020-04-04

维生素D是可以呈现胆钙化固醇生物活性的所有固醇类衍生物的统称，现已知的维生素D共有5种，其中生理功效比较显著的是维生素D2和D3，GB 14880—2012[1]中规定允许添加的也是这2种。维生素D脂溶性强，在碱性、中性溶液中耐热，不易被氧化，但光与酸能促进其异构作用，一般应储存于无酸、无光、氮气或无氧的冷环境中。

维生素 D 是

维持人体正常生长发育、骨骼和肌肉功能的重要物质，对骨骼及视力发育、繁殖和免疫功能有重要影响[2-4]，但摄入过量的维生素D会引起中毒。GB 14880—2012中维生素D的允许添加量较低且对光敏感的性质，给检测带来了挑战。因此，建立准确可靠、灵敏度高的食品中维生素D检测方法尤为重要。有关维生素D的分析方法比较常用的是高效液相色谱法[5-11]，但该方法灵敏度不高、专属性不强，对前处理要求较高。二维色谱的应用，简化了前处理步骤，但二维液相对仪器要求较高，目前二维色谱本身也并未推广开来。液相色谱-质谱联用技术具有灵敏度高、特异性强的特点，被越来越多地应用于维生素D的测定中[12-17]。国标对于普通食品中维生素D的测定也是采用液质联用法，但是对于配方食品的测定仍采用高效液相色谱法[18]。该研究优化了样品前处理方法，建立了高效液相色谱-串联质谱法测定普通食品及配方食品中维生素D的方法，采用同位素内标定量，有效降低了基质干扰，提高了测定结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材。

伊利金装婴儿配方奶粉、黄金搭档中老年型多种维生素片、维维高钙多维豆奶粉、伊利纯牛奶，超市采购;不含维生素D的奶粉基质，企业提供。

1.1.2 试剂。

α-淀粉酶，酶活力≥1.5 U/mg，广东环凯微生物科技有限公司;氢氧化钾、无水硫酸钠、无水乙醇、石油醚30～60 ℃、乙醚、正己烷、氯化钠、抗坏血酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司;甲醇，色谱纯，美国天地有限公司;去离子水;甲酸铵，色谱纯，Aldrich。

维生素D2标准品：AccuStandard（纯度≥98%）;维生素D3标准品：AccuStandard（纯度≥98%）;内标d3-维生素D3：Aldrich（纯度≥97%）。

1.1.3 仪器。

AE163电子分析天平，瑞士METTLER公司;Agilent 1290超高压液相色谱仪，美国安捷伦公司;AB API 4000三重四极杆质谱仪，美国AB Sciex公司;超声波清洗机SB-5200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司;旋转蒸发仪，瑞士BuchI公司;数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司;Milli-Q纯水仪，美国Millipore公司;振动混合器，上海青浦沪西仪器厂;氮吹仪（N-EVAP112），美国Organomation Association Inc。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制。

准确称取适量标准品，分别用无水乙醇溶解并定容至100 mL 棕色容量瓶中。维生素D2和维生素D3标准储备液配制后需要通过紫外吸光度进行校正，具体步骤同GB 5009.82—2016附录B，于-18 ℃ 下避光保存。根据需要用甲醇逐级稀释，配成适当浓度的混合标准溶液，现用现配。

1.2.2 样品提取。

称取约5 g固体样品或50 g液体样品于250 mL三角瓶中，加入100 μL 1 μg/mL的d3-维生素D3溶液，加入1 g淀粉酶，固体样品用约50 mL 50 ℃的温水使其溶解并混匀，于60 ℃恒温箱中温孵30 min，取出后立即冷却到室温，向冷却后的酶解液中加入1.5 g抗坏血酸、100 mL乙醇、25 mL浓度为1.25 g/mL的氢氧化钾溶液，混匀，充氮排出空气，盖上瓶塞，将三角瓶置于80 ℃恒温水浴内皂化45 min，取出后立即冷却到室温。

将皂化后的溶液全部转移到500 mL分液漏斗中，并用水清洗多次以转移完全。在分液漏斗中加入约100 mL正己烷进行萃取，取正己烷层;重复萃取2次，合并正己烷溶液，用水洗4～5次至近中性。将正己烷溶液经无水硫酸钠过滤脱水，用500 mL圆底烧瓶收集所得到的滤液，于40 ℃充氮条件下旋转蒸发至近干。残渣用正己烷转移至试管中，40 ℃条件下氮气吹干，加入5.0 mL 甲醇，超声溶解残渣，过0.22 μm有机膜待测定。

1.2.3 仪器条件。

1.2.3.1 色谱条件。色谱柱：Agilent XDB-C18（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）;流动相：10 mmol/L甲酸铵甲醇溶液，等度洗脱;流速：0.2 mL/min;柱温：30 ℃;进样量：10 μL。

1.2.3.2 质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：正离子扫描;检测方式：多反应监测模式（MRM）;喷雾电压：5 500 V;喷雾气（GS1）气压为55 Pa，辅助气（GS2）气压为45 Pa，气帘气（CUR）气压为20 Pa，碰撞气（CAD）气压为12 Pa，离子源温度为550 ℃，碰撞室入口电压（EP）为10 V，碰撞室出口电压（CXP）为15 V。维生素D2和D3的质谱分析参数如表1所示。

1.3 数据处理

使用美国AB Sciex公司的Analyst和MultiQuant软件采集数据并进行定性定量分析，使用Microsoft Excel 2003进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 淀粉酶对维生素D回收率的影响。

在其他试验条件相同的情况下，同时测定加入和不加淀粉酶的样品，结果显示，添加淀粉酶的样品回收率相对较高。淀粉酶可以使食品中的淀粉酶解，减少基质干扰，提高回收率。另外，市售维生素D原料多数会经过淀粉包埋以提高其稳定性，淀粉酶有破包埋的作用，可以使淀粉包埋的維生素D游离出来。

2.1.2 皂化条件的选择。

样品能否被皂化完全直接影响测定的准确性，考察不同的皂化温度（53、65、75、80和85 ℃）和皂化时间（30、45和60 min）下维生素D的提取效率。结果显示，在温度达到80 ℃之前，维生素D的回收率随着温度的升高而增大，但当温度超过80 ℃后，回收率变小，这可能是因为当温度较低时，食品中脂类物质含量较高，会出现皂化不完全的情况，而当温度达到85 ℃时，溶液中的乙醇达到其沸点，沸腾现象严重，反应过于剧烈。综合考虑，维生素D的皂化温度设定为80 ℃。皂化时间方面，皂化30 min时，回收率最高，这可能是因为随着皂化时间的延长，维生素D发生了降解，综合考虑，30 min为最适合的皂化时间。

2.1.3 提取溶剂的选择。

在其他条件相同的情况下，分别考察石油醚、乙醚、正己烷作为提取溶剂的提取回收率。乙醚和皂化液互溶，乳化严重，难以分层，回收率较低;正己烷也存在乳化现象，但加入适量无水乙醇，因为乙醇可以促进蛋白沉淀，会加速分层，且正己烷较石油醚的回收率高，因而选择正己烷作为提取溶剂。

2.2 色谱条件的选择

试验比较了APCI[19]和ESI[20-21]正离子模式下维生素D2和D3的响应，发现ESI正离子模式下待测物质响应较好，分子离子峰丰度较高，因而选择ESI+模式。

正离子模式下，乙腈会存在一定的离子抑制作用，而甲醇灵敏度较高，因而选择甲醇作为流动相。比较了甲醇-水、甲酸铵甲醇-水、甲酸甲醇-水、乙酸铵甲醇-水的流动相体系，发现流动相为甲酸铵甲醇-水时，待测物质响应较好。图1为上述色谱质谱条件下获得的维生素D2和D3标准溶液MRM色谱图。

2.3 线性范围和检出限

分别配制维生素D2和D3浓度为5、10、20、100、200 和500 ng/mL标准溶液，以待测物质与内标色谱峰峰面积比值为纵坐标、待测物质浓度为横坐标绘制维生素D2、维生素D3标准曲线，结果表明，在 5～500 ng/mL 浓度范围内线性关系良好。在空白奶粉样品中添加混合标准溶液，分别以3倍和10倍信噪比来确定方法的检出限和定量限，结果发现（表2），维生素D2和D3的检出限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg。

2.4 回收率与精密度试验

分别在不含维生素D的奶粉基质中添加5、10、20、100 μg/kg维生素D2和维生素D3的混合标准溶液，按照样品前处理方法进行测定，每个浓度水平重复6次。由表3可见，维生素D2和维生素D3的平均回收率为83.1%～105.4%，相对标准偏差（RSD）为4.3%～8.7%。

2.5 实际样品测定

根据此方法对市售的牛奶、保健品、豆奶粉及奶粉中的维生素D含量进行测定，每批平行测定3次，计算各样品中维生素D浓度，可见测得量和标签标示量较为一致，但是牛奶的维生素D在营养标签上未明显标注;GB 5009.82—2016中规定维生素D的含量是以维生素D2与D3的含量之和计，但是上述4种产品中均只含有维生素D3，日常检测工作中，多数产品也仅可测到维生素D3。结果见表4。

3 结论

该研究建立了超高压液相色谱-串联质谱测定食品中维生素D的方法，结果表明，维生素D2和D3在5～500 ng/mL线性关系良好，二者检出限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg;在各浓度水平下，二者回收率为83.1%～105.4%，RSD为4.3%～8.7%。该方法同时满足了定性定量分析的要求，样品无需经制备液相再次净化富集，简化了样品前处理过程。方法简单、准确度好、灵敏度高，可满足实际检测工作的需要。

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