?固定与释放条件对乳酸菌活性的影响?

马红梅 唐超英 皮子瑶 张汉花

摘 要：为优化乳酸菌固定成球的条件，研究以海藻酸钠为载体，通过单因素试验和正交试验考察了海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、菌液添加量、滴球速度等对乳酸菌固定成球的影响，并以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液释放固定化小球，考察处理时间与pH值对乳酸菌固定化小球释放效果的影响。结果表明：当海藻酸钠浓度为2.0%、CaCl2浓度为2.5%、菌液添加量为20 mL（菌液添加量与无菌水比值为1∶1）时，乳酸菌固定化小球成球性能最佳;pH值为6.0～6.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液可在30 min内完全释放固定化小球。研究还测定了德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和屎肠球菌（Enterococcus Faecium）3种乳酸菌固定化前后菌体的活性，发现德氏乳杆菌和嗜热链球菌的活性在固定化前后差异不显著，但屎肠球菌的活性在固定化前后的差异较大。

关键词：乳酸菌;固定化;释放;活性

中图分类号：Q937文献标识码：A文章编号：1006-060X（2020）10-0050-03

Abstract： In order to optimize the conditions for solidifying lactic acid bacteria into pellets， this study used sodium alginate as a carrier to investigate the effects of sodium alginate concentration， CaCl2 concentration， the amount of bacteria solution and dropping speed on the solidification of lactic acid bacteria into pellets by single factor test and orthogonal test. Furthermore， the solidified lactic acid bacteria pellets were dissolved in citric acid-sodium citrate buffer solution to detect the effects of treatment time and pH value on the activity release of lactic acid bacteria. The results showed the pellet-forming performance of lactic acid bacteria was the best when the concentration of sodium alginate was 2.0%， the concentration of CaCl2 was 2.5%， and the addition of bacterial solution was 20 mL （the ratio of bacterial solution to aseptic water was 1∶1）. Citric acid-sodium citrate buffer （ pH 6.0 ～ 6.5） can completely dissolve lactic acid bacteria pellets within 30min. The activities of Lactobacillus delbrueckii， Streptococcus thermophilus and Enterococcus faecium were detected before and after solidification. It was found that the activities of Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus had no significant difference before and after solidification， but the activity of Enterococcus faecium varied obviously before and after solidification.

Key words： lactic acid bacteria; solidification; release; activity

微生物的固定化是指将微生物固定在不溶性的载体上，它不仅可提高单位体积内微生物的生产效率和生产能力，还能延长微生物的生长周期，便于微生物的回收和利用[1]。在固定微生物的过程中，需要选择合适的载体。最常用的载体为包埋载体，它有2种类型，一种是无机载体，另一种是有机载体，前者包括活性炭等，后者包括海藻酸钠、聚乙烯醇等。 由于琼脂和壳聚糖凝胶的硬度差，聚乙烯醇和聚丙烯酰胺凝胶有毒，而海藻酸钠凝胶具良好的综合性能，不会毒害生物细胞，且易降解，更适用于微生物细胞的固定[2-3]。有关乳酸菌固定化的应用报导较多，但对固定与释放条件对微生物生长的影响的报导并不多见。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、屎肠球菌（Enterococcus Faecium），均购自广东环凯微生物科技有限公司;主要试剂有海藻酸钠为食用级，氯化钙、柠檬酸、柠檬酸三钠等为分析纯;培养基为LB培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 不同因素对固定化乳酸菌成球的影响 （1）海藻酸钠浓度对乳酸菌固定化的影响。将海藻酸钠分别配成4.0%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%的胶体液。用9号针管吸取上述胶体液，以一定速度滴入浓度为1.5%氯化钙溶液中固化20～30 min。（2）CaCl2浓度对乳酸菌固定化的影响。将CaCl2配成浓度为0.5%、2.5%、1.5%的溶液。将浓度为2.5%含菌海藻酸钠溶液以一定的速度分别滴入不同浓度的CaCl2溶液中固化20～30 min。（3）菌液添加量。将3种乳酸菌活化长满斜面后制成5、10、20、30 mL菌悬液，分别加入海藻酸钠胶体液中搅拌均匀。用针管吸取胶体液，以一定的速度滴入浓度为1.5% CaCl2溶液中固化20～30 min。（4）滴球速度。在海藻酸钠浓度为2.5%及菌液添加量为20 mL的条件下，以秒表计时，以不同的速度將混合液滴入1.5% CaCl2溶液中固化20～30 min。

1.2.2 正交试验设计 在1.2.1的基础上，选择对固定化乳酸菌小球成球影响因素较大的3个因素即海藻酸钠浓度（A）、CaCl2浓度（B）、菌液添加量（C）进行L9（3）4正交试验，试验因素及水平设计如表1，固定化小球成球性能评分标准参考贺银凤等[4]的研究。

1.2.3 固定化乳酸菌球的释放 取浓度分别为0.1 mol/L的柠檬酸溶液及柠檬酸钠溶液，按表2配成 pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。每支试管中加入5 g干燥的固定化乳酸菌小球，震荡30 min，记录各试管中固定化小球的释放情况。

1.2.4 固定化乳酸菌的活菌计数 将德氏乳杆菌、嗜热链球菌、屎肠球菌菌原液以及固定化的3种乳酸菌小球分别稀释至10-6、10-7和10-8后，在LB培养基中涂布于37℃培养箱内培养24 h计数。

1.2.5 统计分析 采用Minitab 17（中文版）对正交设计数据进行显著性分析;采用SPSS 19.0软件对两配对样本进行t检验。

2 结果与分析

2.1 不同因素对固定化乳酸菌成球的影响

2.1.1 海藻酸钠浓度 不同浓度的海藻酸钠对固定化乳酸菌小球的影响见表3。由表3可知，海藻酸钠浓度会影响小球的成型。当浓度低于1.5%时，由于海藻酸钠胶体液浓度过稀，挤球时容易连成线，难成球;当浓度在1.5%～2.5%时，海藻酸钠胶体液浓度适中，挤球容易，且成规则球形;当浓度在3.0%时，海藻酸钠胶体液浓度过稠，成球不规则，带尾巴;当浓度在4.0%以上时，海藻酸钠胶体液浓度过稠，容易堵塞针口，挤球困难，带尾巴。

2.1.2 CaCl2浓度 不同浓度的CaCl2对固定化乳酸菌成球的影响见表4。CaCl2浓度决定着凝胶球的硬度。由表4可知，当浓度在1.5%以下，凝胶球硬度一般;当浓度大于1.5%时，小球的硬度良好。研究表明，浓度越低，固定化凝胶球的性能越差，浓度越高，微生物细胞的活性越差。

2.1.3 菌种添加量 不同菌液添加量对固定化乳酸菌成球的影响见表5。由表5可知，菌液的量对成球的影响不大。添加的细菌数量直接影响固定化乳酸菌凝胶球的细菌含量。当菌液添加量少于10 mL時，固定化乳酸菌凝胶球的含菌量相对较少，在实际应用过程中会影响试验结果。因此，在实际应用过程中，当海藻酸钠浓度为2.5%时，菌液添加量与无菌水的比值在1/3～1都是比较合适的。

2.1.4 滴球速度 在2.5%的海藻酸钠、1.5%的CaCl2、菌液添加量20 mL（菌液添加量与无菌水比值为1∶1）的情况下，不同滴球速度对固定化乳酸菌成球的影响见表6。由表6可以看出，滴球速度影响小球的成型及大小。速度小于等于80个/min时，均易成球，且大小适中。当滴定速度大于106个/min时，虽易成球，但球形大小不一，当速度为148个/min时，不能形成小球，易成线性，且线性大小不规则。相关研究表明，固定化乳酸菌球的大小对包埋的量有影响，成球越大，固定的量越少，但总体差异不大。因此在实际操作过程中，只要不连成线，滴球速度可以尽量快。

2.2 正交试验统计及方差分析

各因素对固定化乳酸菌成球影响的结果见表7，各因素对固定化小球的固化影响的差异性见表8。由表7可知，3个因素的极差值均大于空列的极差值，说明3个因素有显著影响效果。其中A>B>C，即海藻酸钠浓度对成球的影响最大，其次是CaCl2浓度，菌液添加量的影响最小。表8方差分析结果表明， A和B的P值均小于0.05，说明海藻酸钠的浓度与CaCl2浓度对固定化小球成球的影响有显著差异;C值的P值大于0.05，表明菌液量对固定化小球的成球影响不显著，此与表7的结果一致。综合分析得出，固定化乳酸菌小球的最优成球条件组合为A2B2C2，即海藻酸钠浓度为2.0%、CaCl2浓度为2.5%、菌液添加量为20 mL（菌液添加量与无菌水比值为1∶1）。

2.3 固定化乳酸菌小球的释放试验结果

由表9可知，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液释放固定化乳酸菌小球时，时间和缓冲液的pH值均会影响小球释放程度，当处理时间小于20 min时或pH值小于6.0时，固定化小球均不会释放，pH值越大，固定化小球越容易释放;当pH值≥6.0时，固定化小球在30 min内完全释放。

2.4 固定化对乳酸菌活性的影响

固定化对3种乳酸菌活性的影响如表10。由表10可知，德氏乳杆菌和嗜热链球菌在固定化前后的活性变化不明显，而屎肠球菌的活性在固定化前后变化显著。德氏乳杆菌固定化后活性依然很高，活菌数高达94.4%;嗜热链球菌次之，为81.0%;固定化对屎肠球菌的活性影响最大，固定化处理后活菌率为70.0%，由此可见，固定化对不同种类乳酸菌的活性影响不一样。

3 结 论

乳酸菌固定化小球成球性能最佳条件与张强等[5]、汪洋等[6]研究固定化小球的条件基本一致;使固定化乳酸菌小球迅速释放的条件为pH值6.0～6.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，此法对不同乳酸菌固定化前后的活性影响不一样，其中对屎肠球菌的影响较大，其原因可能是固定化方法或固定化载体影响了菌体生长[7]，也可能是屎肠球菌的释放pH值与生长pH值不一致导致的。

参考文献：

[1] 左昌平. 固定化细胞技术在废水处理中的运用分析[J]. 环境与发展，2017，29（6）：120-121.

[2] 蒋宇红，黄 霞，俞毓馨. 几种固定化细胞载体的比较[J]. 环境科学，1993，14（2）：11-15，92.

[3] 杨旭俊，蔡冠竟，郑 伟，等. 固定化微生物技术在受污养殖水体和水华水域生物修复中的应用[J]. 微生物学通报，2015，42（4）：712-720.

[4] 贺银凤，午日娜，王建华. 乳酸菌的固定化方法及其发酵特性的研究[J]. 食品研究与开发，2006，27（5）：16-18.

[5] 张 强，马 齐，徐升运，等. 海藻酸钠包埋乳酸菌及活性分析[J]. 陕西农业科学，2009，55（2）：23-25.

[6] 汪 洋，孔维宝，张馨允，等. 海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化小球藻[J]. 生物学通报，2015，50（9）：50-53.

[7] 王建龙. 固定化对微生物生理变化的影响[J]. 中国生物工程杂志，2003，23（7）：62-66.

（责任编辑：张焕裕）