平菇胞外酶研究进展综述

方洪枫 赵光辉 吴汉琼 郑英姿 林 原 陈 剑 陈躬国

平菇胞外酶研究进展综述

方洪枫 赵光辉 吴汉琼 郑英姿 林 原 陈 剑 陈躬国

（福州市农业科学研究所，福州 350018）

介绍平菇胞外酶的两种常用研究方法：鉴别平板检测法和分光光度法。从纤维素酶系和木质素酶系两大种类概述平菇胞外酶研究的最新进展及主要成果，对平菇胞外酶的进一步深入研究提出构想。

平菇；胞外酶；平板检测；分光光度；纤维素酶；漆酶

酶由活细胞产生，是对相应底物具有特异性催化作用的蛋白质或RNA。胞外酶是指在细胞外起作用的酶。平菇是有一定栽培规模的可食用大型真菌，在其生长发育过程中菌丝能够分泌大量胞外酶。平菇的胞外酶将培养料中大分子的纤维素和蛋白质分别分解成小分子的单糖和氨基酸，提供营养物质帮助菌丝生长和子实体发育。国内以平菇菌种选育和栽培技术等方面的研究为主，对胞外酶的研究报道并不多。根据目前已发表的文献，对平菇胞外酶的研究多集中于水解酶类，如漆酶、羧甲基纤维素酶、淀粉酶和多酚氧化酶。本文综述平菇胞外酶活性的两种研究方法和对两类胞外酶的最新研究进展，为进一步研究平菇胞外酶提供理论参考。

1 研究方法

1.1 鉴别平板检测法

鉴别平板检测法是快速筛选菌株的方法，包括平板透明圈法和平板变色圈法。平板透明圈法是在固体培养基中掺入营养物质，待测菌株产生特定胞外酶分解营养物质，在菌落周围形成透明圈。平板变色圈法是指在固体培养基中掺入指示剂，绝大多数胞外酶能够与某些特定的物质在短时间内发生显色反应[1]。透明圈和变色圈的大小能够反映菌株利用和分解营养物质或指示剂等特定物质的能力，根据圈的大小，可初步判断菌株产胞外酶的能力高低。

龚娜等以不同含量的纯玉米芯为唯一碳源，采用刚果红平板变色圈法快速筛选出产胞外纤维素酶的平菇菌株，能很好解决过去栽培周期长、空间大等条件限制的问题[2]。韦锦范采用愈创木酚、单宁酸和ABTS为底物的培养基初步筛选平菇产漆酶能力，根据透明圈/菌丝圈大小和变色特征，获得8个漆酶活力较高的菌株[3]。高锋等通过平板变色圈试验发现，选用的平菇菌株能分泌羧甲基纤维素钠酶、淀粉酶、漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶等5种胞外酶[4]。应立立等通过平板变色圈法筛选平菇木质素降解菌株，结果以红平菇降解木质素的能力最强[5]。宋安东等对不同平菇菌株在PDA-Bavendamm平板和PDA-RB亮蓝平板上进行显色试验，根据菌株在PDA-Bavendamm平板上形成的棕褐色轮环和在PDA-RB亮蓝平板上形成的橙黄色变色圈，检测出33个菌株能产漆酶，所有平菇菌株均可产生过氧化物酶[6]。

鉴别平板检测法是从大量食用菌菌株中筛选产目标胞外酶菌株的常用方法，是找到目标菌株及判断其能否产酶的关键基础步骤，可以简单快速地辨别出该菌株是否产酶，为平菇等多种食用菌的产酶菌株筛选减少了大量的工作量和不必要的人力、物力消耗。同时通过透明圈或变色圈的直径大小与菌落直径大小的比值，可初步评价菌株的产酶能力，为后续定量测定酶活力大小提供参考。

1.2 分光光度法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长内的吸光度，对该物质进行定性和定量分析的方法。这是生物化学实验中最常用的方法之一，常见如用ABTS法测漆酶，DNS法测还原糖。

胡素娟等采用DNS法测定羧甲基纤维素酶活性，采用ABTS法测定漆酶活性，采用紫外分光光度计法测定中性蛋白酶活性，对比玉米芯、棉籽壳基质发酵料栽培平菇不同生长阶段平菇胞外羧甲基纤维素酶（CMC）、木聚糖酶、中性蛋白酶和漆酶的活性[7]。周孟清等用分光光度法等对粗酶液的酶活性质研究结果，平菇可产锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac）[8]。Sathishkumar和Palvanan取平菇液体培养对数期发酵液测漆酶活性，以ABTS作为反应底物，浓度1 mmol/L，100 mmol/L反应缓冲体系为醋酸溶液反应体系，pH 5.5，反应温度为30 ℃，在420 nm波长下测定吸光度[9]。最近，也有研究者采用愈创木酚法测定侧耳属的漆酶活性[10]。

分光光度法是实验室定量检测平菇菌株中胞外酶的方法，长时间的大量其他实验已证明该方法的精确性、可重复性，及其所得实验结果的快速、安全、可靠，克服了平板检测法中菌株易受培养基厚度和pH值、指示剂的影响，以及受观察时间、培养温度等客观因素的干扰等问题，能够进一步验证和支持鉴别平板法的检测结果。

2 胞外酶种类

2.1 纤维素酶系

纤维素酶可以将大分子纤维素分解成寡糖或单糖的蛋白质，在分解纤维素时起生物催化作用。平菇栽培主要以含有大量纤维素的棉籽壳、木屑、棉秆等为原料，胞外纤维素酶可将纤维素分解成小分子营养物质供菌丝体吸收、利用和子实体生长发育。羧甲基纤维素酶、滤纸酶皆属于纤维素酶系。

温海祥等通过比较平菇不同品种间羧甲基纤维素酶的酶活大小，发现品种间纤维素酶活力存在显著差异[11]。孙江慧等研究发现平菇‘韩黑’分泌的纤维素酶活力较高，纤维素降解率高达45.84%，是产纤维素酶的优势菌株[12]。冯光志等研究发现，Zn2+能促进平菇胞外羧甲基纤维素酶的产生，在菌丝生长期胞外羧甲基纤维素酶活性较弱，之后逐渐升高，在子实体成熟期，达到峰值，为19.87 U/g，子实体采摘后酶活随之下降[13]。洪培等研究表明，Zn2+和Mn2+有效提高了纤维素酶活性，而Fe2+和Cu2+则抑制产酶活力[14]。傅真杰等发现适量 Mn2+和 Mg2+能促进平菇菌丝发育和子实体形成，其中Mg2+能较大程度提升平菇纤维素酶活力，0.125 g/L Mg2+可使平菇纤维素酶活提升45. 05%[15]。

纤维素酶是平菇胞外酶研究中最常见的一类，目前研究主要集中在比较不同平菇品种间纤维素酶的活力和如何提高平菇纤维素酶活力。研究纤维素酶对平菇生产具有一定的指导意义，如筛选高产平菇菌株，生产过程中添加微量元素提高产量等。

2.2 木质素酶系

漆酶和多酚氧化酶都是降解木质素的重要催化剂，属于木质素酶系。它们将木质素芳香族高分子化合物分解为小分子物质供菌丝生长。胞外漆酶和多酚氧化酶活性越强，菌株降解木质素的能力就越强。

孙江慧等通过试验比较，发现平菇8号降解木质素的能力较强，木质素降解率可达49.46%[12]。吴楠等研究的结果，红平菇在大豆秸秆基质中产漆酶活性最强，菌丝生长旺盛，推测大豆秸秆中木质素含量较高，有利于促进平菇产漆酶[16]。玄家洁对平菇双抗、860、89等3个品种进行摇瓶发酵，比较菌丝长势和漆酶活力，发现菌丝的生长势与漆酶活力大小具有相关性[17]。周佳君等研究发现多酚氧化酶与平菇的褐变有关，因此提出在平菇的生产储存与运输过程中应避免促进多酚氧化酶产生的因素，以降低平菇的耗损[18]。杨清香等通过在玉米粉液体培养基中进行发酵，发现2个平菇菌株能够在液体发酵液中分泌高活性的漆酶，其中平菇831在液体中产酶活性于第10天达到最大值，为18 053.3 U/L[19]。申进文等对平菇漆酶的研究证实，平菇在菌丝生长阶段的漆酶活性最高，进而发现在第一、二潮菇的间期，漆酶活性出现次高峰[20]。陈建军等通过测定平菇在种子袋内和出菇后不同生长阶段的漆酶酶活，发现平菇831在菌丝生长时期漆酶的分泌量最高，最大值为151.6 U/g，而出菇后的漆酶酶活几乎降为0。说明菌丝生长需要漆酶参与，而子实体的发育则不再需要漆酶的参与[21]。

3 深入研究构想

我国的平菇种类多、产量高，具有明显的种质资源优势，开展平菇胞外酶的研究，对于提高平菇产量和合理开发利用种质资源具有重要意义。在有关平菇胞外酶的研究中，对漆酶的研究较为深入，也取得了一定的成果，但仍有很大的研究空间。目前大多数试验仍处于实验室研究阶段，并未将试验结果运用于实际生产中。对于平菇漆酶的合成、作用机理和规律，酶的分离、纯化及应用于规模化生产等，都有待于进一步的深入研究。关于平菇胞外酶活性的测定，可以探寻更多的方法，通过比较不同研究方法之间的准确性，优选出最适合的一种。随着分子技术和基因工程的不断进步发展，将会有更多平菇的纤维素酶系和木质素酶系的编码基因被分离出来，可为平菇转基因研究提供丰富的目的基因源，进一步促进平菇的研究。

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福建省福州市科技计划项目（2017-N-46），现代农业产业技术体系建设专项资金资助（CARS24）

方洪枫（1991—），女，硕士研究生，研究实习员，研究方向为微生物生理生化， E-mail：515512489@qq.com。

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