脂联素基因单核苷酸多态性与多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗的关系研究

朱艳 周琴 安洁 张剑治 李娟

摘要：目的  探討脂联素浓度、脂联素基因第2外显子的+45T/G（rs2241766）和第2内含子的+276G/T（rs1501299）两个多态性位点、PCOS伴胰岛素抵抗（IR）三者的关系，并探讨其是否可以为临床诊疗及预后提供数据依据。方法  收集2017年1月～2019年1月昆山市中医医院就诊年龄在20～35岁，符合鹿特丹标准的PCOS患者和正常人各100例。采用分子生物学的方法对脂联素基因进行分型。比较两组临床资料、脂联素浓度及脂联素基因分型。结果  PCOS组的雄激素、雌激素、促黄体生成素、胰岛素、胆固醇、甘油三酯、血糖高于对照组（P<0.05）;对照组的促卵泡生成素、泌乳素低于 PCOS 组（P<0.05）;PCOS组脂联素水平和IR存在线性关系（P<0.05）;对照组脂联素基因多态位点+276G/T（ rs1501299）不符合 HWE 遗传定律，组间无法比较;两组+45T/G（rs2241766）位点的基因型（TT、TG、GG）频率分布比较，差异无统计学意义（P>0.05），此位点基因型频率与脂联素浓度、HOMA-IR进行关联分析，差异无统计学意义（P>0.05）。结论  PCOS 组的脂联素水平和IR呈负相关，脂联素基因+45T/G（rs2241766）位点基因分型与PCOS伴IR患者无显著关系，可能不参与 PCOS 发生。

关键词：多囊卵巢综合征;胰岛素抵抗;脂联素浓度;脂联素基因多态性;+276G/T（rs1501299）;+45T/G（rs2241766）

中图分类号：R711.75                               文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.22.025

文章编号：1006-1959（2020）22-0087-05

Study on the Relationship Between Adiponectin Gene Single Nucleotide Polymorphism

and Polycystic Ovary Syndrome with Insulin Resistance

ZHU Yan，ZHOU Qin，AN Jie，ZHANG Jian-zhi，LI Juan

（Department of Gynecology，Kunshan Traditional Chinese Medicine Hospital，Kunshan 215300，Jiangsu，China）

Abstract：Objective  To investigate the adiponectin concentration， the +45T/G （rs2241766） and +276G/T （rs1501299） polymorphisms in the second exon of the adiponectin gene， and PCOS with insulin resistance （IR） The relationship between the three and explore whether it can provide data for clinical diagnosis and treatment and prognosis.Methods  From January 2017 to January 2019， 100 PCOS patients and 100 normal people who were 20-35 years old and met the Rotterdam standard were collected from Kunshan Traditional Chinese Medicine Hospital. Adiponectin genes were typed using molecular biology methods. The clinical data， adiponectin concentration and genotype of adiponectin were compared between the two groups. Results  Androgen， estrogen， luteinizing hormone， insulin， cholesterol， triglyceride， and blood sugar in the PCOS group were higher than those in the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）; the control group had low follicle stimulating hormone and prolactin the PCOS group， the difference was statistically significant （P<0.05）; there was a linear relationship between adiponectin levels and IR in the PCOS group （P<0.05）; Adiponectin gene polymorphic site +276G/T （rs1501299） in the control group does not comply with the HWE genetic law and cannot be compared between groups; the frequency of genotypes （TT， TG， GG） at +45T/G （rs2241766） sites in the two groups the distribution comparison showed no statistically significant difference （P>0.05）. The correlation analysis between the genotype frequency of this locus and the adiponectin concentration and HOMA-IR showed that the difference was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion  The level of adiponectin in the PCOS group is negatively correlated with IR. The genotyping of adiponectin gene +45T/G （rs2241766） has no significant relationship with patients with PCOS with IR， and may not be involved in the occurrence of PCOS.

Key words：Polycystic ovary syndrome;Insulin resistance;Adiponectin concentration;Adiponectin gene polymorphism;+276G/T （rs1501299）;+45T/G （rs2241766）

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种多基因遗传、临床异质性、不可治愈性、进展性发展的内分泌功能紊乱性疾病，具有较高的发病率，据近期流调学统计全球发病率为5%～15%，而在我国汉族育龄期女性中的发病率为5.6%，占排卵障碍性不孕症的30%～60%，甚至更高，亟待解决[1]。PCOS目前仍病因不清，且缺乏有效的治疗手段，尚无法达到完全恢复下丘脑-垂体-卵巢轴的平衡性，临床也常见子宫内膜病变、心理病变、乳腺疾病、代谢综合征等[2]，严重影响了女性的身心健康。研究表明，脂肪组织可分泌出多种细胞因子来参与机体内分泌代谢及免疫等活动。脂联素（APN）作为脂肪细胞分泌的主要的能量调节因子之一，与胰岛素敏感性、葡萄糖摄取和脂质代谢密切相关[3]。亦有研究证实了血清脂联素与PCOS胰岛素敏感性两者间有较强关联性，认为脂联素不仅参与PCOS胰岛素抵抗（IR）的发生和发展过程，同时也与PCOS的发病有关。但部分研究者持相反态度[4]，认为脂联素与PCOS没有明显的相互关系。近年来，脂联素基因（ADIPOQ）与 PCOS相关性的研究也成为国内外学者关注的热点。目前研究已发现的ADIPOQ单核苷酸多态性（SNP）位点就有近30个，大多集中在第2外显子的rs2241766和第2内含子的rs1501299两个多态性位点上。研究发现[5-7]，这2个多态性位点与肥胖、心血管疾病、IR和2型糖尿病密切相关。但是目前为止，这两个多态性位点与PCOS相关性的研究结果尚有争议。本研究通过分析 ADIPOQ 的上述2个多态性位点在PCOS患者与对照组之间基因型及等位基因频率分布的差异，及脂联素浓度与PCOS间的关系，来研究其是否与PCOS发病存在相关性，以期为PCOS的病因探索提供数据依据。

1资料与方法

1.1一般资料  经昆山市中医医院伦理委员会审查同意，收集2017年1月～2019年1月昆山市中医医院就诊年龄在20～35岁，BMI在19～24（kg/m2），排除标准：①近3个月内使用抗生素、糖皮质激素、避孕药、促排药、抗糖尿病药、降压药、精神类药等药物史;②近期任何手术史;③有胃肠道疾病、活动性感染、吸烟酗酒者。符合疾病诊断标准的PCOS患者100例，健康人群100例作为对照组，研究对象均知情同意。

1.2诊断标准  选用欧洲人类生殖和胚胎学研究中心和美国生殖医学会（ESHRE/ASRM）2003年1月颁布的鹿特丹标准作为病例诊断标准。排除以下疾病：如卵巢或肾上腺分泌雄激素肿瘤、高催乳素血症、低促性腺激素低性腺激素性闭经、柯兴氏综合征（cushing）、迟发性先天性肾上腺皮质增生、甲状腺功能异常。临床至少需符合下述3条标准的其中2条：①很少排卵或不排卵;②高雄激素的临床和（或）生化表现（临床如：多毛、痤疮、男性型脱发，生化：高水平的血清睾酮（T）或游离T，或自由雄激素指数（FAI）或硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）升高;③超声下的改变：任何一侧卵巢的直径在29 mm，存在≥12个卵泡，或（和）卵巢的体积>10 ml。

1.3方法

1.3.1临床指标  性激素、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS），计算HOMA-IR水平[HOMA-IR=FINS（mU/L）×FBG（mmol/L）/22.5]、甘油三酯，胆固醇、脂联素浓度。于月经正常来潮或闭经患者于孕酮撤退性出血月经周期的第3天上午（9～10时）空腹并静坐约15 min后再抽取肘静脉血。并用含有EDTA的抗凝管收集5 ml静脉血。取1 ml保存到EP管-80 ℃保存。将剩余的血液放入离心机中4 ℃，1500 rpm，离心10 min，收集管中上部分黄色血清放到-80 ℃保存。

1.3.2脂联素基因分型检测  采取经典酚-氯仿经典方法提取外周血基因组DNA（基因组 DNA 提取试剂盒选自上海生工）。根据脂联素基因的核苷酸序列设计各个位点的扩增引物使用PCR扩增目的基因片段。PCR扩增引物序列见表1，PCR反应体系（25 μl） 包含100 ng提取DNA，1.0 UTaq酶，2 μl上游以及下游引物2×PCR buffer。PCR反应条件：95 ℃变性6 min，94 ℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃45 s 30个循环，最后72 ℃延伸10 min。限制性内切酶酶SmaI和BsmI酶切（Themo，美国）。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，加入3μl GelRed 核酸染料，电泳结束后，打开凝胶显影仪，观察并记录结果。

1.4统计学方法  本研究资料采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。运用Shapiro-Wilk test结合正态图检验所分析数据的正态性。基因多态性位点进行 HEW 遗传平衡检验。按照定律所述，通过各种基因型的頻率计算等位基因的频率，由等位基因的频率计算出期望频率值。将实际频率值和期望频率值进行？字2检验，如果P>0.05，那么观望值符合预期值，结果符合HWE定律;如果P<0.05，则观望值不符合预期值，结果不符合HWE定律。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组样本均数比较采用两独立样本t检验，配对样本均数比较采用配对t检验，偏态分布的计量资料以中位数和四分位数 M（Q25，Q75）表示，采用两独立样本的秩和检验，多组比较采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组一般资料比较  PCOS组雄激素、雌激素、促黄体生成素、促卵泡生成激素、泌乳素、胰岛素、胆固醇、甘油三酯、血糖、HOMA-IR高于对照组，脂联素低于对照组，PCOS组初潮月经紊乱发生率高于对照组（P<0.05）;两组年龄、BMI、如饮酒、教育情况、体力劳动情况比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。