UNC13D基因剪接突变所致家族性嗜血细胞综合征1例报告

颜宏利， 王 瑶， 刘明华

海军军医大学第一附属医院生殖医学中心，上海 200433

嗜血细胞综合征，又称嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH)，是一种由免疫紊乱所致的严重威胁生命的血液系统疾病，其特征为发热、肝脾肿大、高三酰甘油血症、凝血障碍和中枢神经系统症状。HLH分为原发性和继发性2种类型，原发性HLH包括家族性HLH (FHL)和遗传性免疫缺陷相关HLH，继发性HLH常与感染、恶性肿瘤、风湿免疫性疾病相关[1-2]。

FHL是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，由基因穿孔素基因(PRF1，导致FHL2)[3]、UNC13同系物D基因(UNC13D，导致FHL3)[4]、突触融合蛋白11基因(STX11，导致FHL4)[5]及突触融合蛋白结合蛋白2基因(STXBP2，导致FHL5)[6-7]突变引起，多在婴幼儿期发病。由于FHL病情凶险、进展迅速，且药物治疗易复发，异基因造血干细胞移植是其治愈的唯一方法，所以对症及时、有效治疗十分重要。然而，婴幼儿在许多疾病中表现为非特异性体征，明确诊断存在一定困难。本文就1例FHL患儿发病及诊断情况报告如下，并回顾相关文献，以供同行参考。

1 病例资料

1.1 一般情况 患儿，女，2月龄，因“发热伴面色苍白4 d”于2015年11月16日收治入院。体格检查：发热，体温最高达39.7℃，面色稍苍白，颜面皮肤可见出血点；口腔散在白色凝乳状物；肝脾肋下约4 cm。患儿哥哥于2013年5月因嗜血细胞综合征去世。

1.2 实验室检查

1.2.1 常规检查 血常规：白细胞4.3×109/L，中性粒细胞绝对值0.47×109/L，血红蛋白61 g/L，血小板22×109/L。肝功能：丙氨酸转氨酶(ALT)265 U/L，天冬氨酸转氨酶(AST)206 U/L，总胆红素(TB) 38.6 μmol/L，直接胆红素(DB) 29.8 μmol/L。三酰甘油(TG)2.43 mmol/L。血浆纤维蛋白原测定：纤维蛋白原(FIB)2.36 g/L；血清铁蛋白>1 650 μg/L。

1.2.2 骨髓细胞学检查 骨髓增生极度活跃，未见嗜血细胞。

1.3 基因分析 经患儿家属同意，留取患儿及其父母静脉血标本行免疫缺陷病基因检查，采用高通量测序技术分析其致病基因，Sanger测序方法对所发现的突变及父母源性进行验证。

患儿溶酶体转运调控基因(LYST)4号外显子检出杂合突变：c.281C>T(p.Thr94Ile)，经家系验证分析，发现该变异来自患儿父亲。UNC13D基因检出2个杂合突变：(1)15号外显子剪接突变(c.1299-1G>A)，该位点可能影响蛋白质编码，但目前尚无相关文献确切报道；(2)28号内含子剪接突变(c.2709+1G>A)，该突变可导致UNC13D的剪接错配[8]。经家系验证分析，(1)、(2)变异分别来自患儿父亲、母亲(图1A～1D)。

进一步对患儿及其父母与正常人UNC13D基因表达量进行相对定量分析。引物序列如下：上游引物为5′-TCT ACG AGG ACG CAC TCT ACA-3′；下游引物为5′-CCT TGG CCT GTT TCA CTG TTG-3′。结果(图1E)发现，与正常对照相比，患儿及其父母UNC13D基因相对表达量显著降低。

图1 UNC13D基因突变家系及基因相对表达量分析

1.4 流式细胞术分析 抽取患儿外周血标本送至北京爱普达检验中心，采用流式细胞术检测自然杀伤细胞(NK细胞)对转染荧光靶细胞的杀伤活性，采用CD107a激发实验检测NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)脱颗粒功能。结果(图2)显示，患儿NK细胞活性为13.93%，较参考值(正常参考范围≥15.11%)降低，说明NK细胞和CTL细胞脱颗粒功能可能存在异常。

1.5 诊疗经过及预后 患儿入院后予抗感染、补充血小板、输注红细胞、丙种球蛋白支持治疗；根据患儿及其父母基因学检查，结合实验室常规检查结果，对照HLH诊断标准(HLH-2004)[9]，患儿FHL诊断明确，根据HLH-2004方案[9]进行化疗。患儿于2岁半时去世。

2 讨 论

FHL是常染色体隐性遗传病，包括FHL1-FHL5 5个亚型，除FHL1的基因突变未知外，FHL2-FHL5亚型分别与PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2相关[3-7]。LYST、RAS原癌基因家族成员RAB27A(RAB27A)基因、接头相关蛋白复合物3亚基β1(AP3B1)基因、含SH2结构域蛋白1A(SH2D1A)基因及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因突变与遗传性免疫缺陷相关性HLH有关[10-13]。

图2 本病例外周血的流式细胞术分析

现将原发性HLH分类及突变基因总结如表1，其中，根据ClinVar数据库，目前已经证实的与FHL相关的UNC13D突变有300多种。研究[14]表明，虽然FHL亚型的基因突变各不相同，但都会导致NK细胞和T细胞的细胞毒性功能受损。在颗粒介导的细胞毒性途径中相互关联，干扰穿孔素介导的细胞毒性功能，从而阻断触发凋亡或激活诱导凋亡机制，细胞毒性T细胞和NK细胞不能有效杀死靶细胞，免疫反应过度激活、持续高炎性状态，引起HLH症状。主要临床表现：与机体免疫反应过度激活相关的发热、贫血、出血、肝脾肿大、中枢神经系统症状等。由于这些症状并非特异性表现，临床医生不一定能在第一时间诊断出HLH。同时，许多患者的相关临床表现往往不会同时出现，并不能严格达到HLH-2004诊断标准[9]8项中的5项。因此，对于疑似患者，推荐及早进行基因诊断和NK细胞、CTL细胞功能检测。

表1 原发性HLH基因分类及致病途径

本例患儿为2个月大的女婴，高热4 d入院治疗。查体发现脾大，外周血三系减少，AST、ALT、TB、DB水平升高，血清铁蛋白增加。骨髓检查排除恶性肿瘤。虽然这些临床表现与HLH诊断标准(HLH-2004)[9]相符，但非特异，结合患儿哥哥因HLH去世的情况，因此高度怀疑此其为FHL。

对患儿及其父母进行基因检测，发现2个与HLH相关的基因存在突变，即LYST基因和UNC13D基因。(1)患儿与其父LYST基因4号外显子区域存在c.281C>T，导致编码的第94位苏氨酸被异亮氨酸代替，为杂合突变，而其母LYST基因4号外显子区域正常无突变，从而，该突变来源于患儿父亲；(2)患儿UNC13D基因15号外显子剪接位点存在c.1299-1G>A(杂合突变)，且UNC13D基因28号内含子区域剪接位点存在c.2709+1G>A(杂合突变)，前者可于其父基因内检测到，后者可于其母基因内检测到，表明患儿UNC13D基因所测得的2个剪接位点突变分别来自其父亲和母亲。

FHL是常染色体隐性遗传病，这意味着一般双等位基因均发生突变才可致病。本例患儿LYST基因虽存在突变，但2个等位基因中仅存在1个等位基因突变，为杂合突变，且患儿父亲也存在该杂合突变且未发病，考虑由LYST基因引发疾病的可能性不大。而患儿UNC13D基因存在分别位于2个等位基因上的剪接位点杂合突变，所以推测UNC13D为致病基因，将该患儿归为FHL3。进一步，根据患儿及其父母UNC13D基因相对定量检测结果进行推测，这是由无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)机制介导的机体识别和降解含有提前终止密码子的转录产物导致的基因表达量降低，导致蛋白发生变化而致病。 本文报告突变与近年报道[15]的1例18岁女性FHL患者UNC13D基因突变位点相同，均为2个剪接位点突变，c.1299-1G>A及c.2709+1G>A，父母也分别是c.1299-1G>A和c.2709+1G>A的携带者，但是两者发病年龄差异较大。NK细胞活性减低或缺失是HLH-2004[9]的8项诊断标准之一，对临床筛查有重要价值。CD107a是一种高糖基化蛋白，约占溶酶体膜蛋白的50%，当细胞毒性颗粒与细胞质膜融合时瞬时在细胞膜上表达[16]。CD107a激发实验对于细胞脱颗粒相关基因(UNC13D、 STX11、STXBP2、RAB27A、LYST及AP3B1)突变的诊断准确度良好，可用于区分是否由遗传因素导致的脱颗粒缺陷，为临床意义不明的基因突变的解释提供帮助。本例患儿NK细胞活性检测及CD107a激发实验结果显示，其NK细胞活性降低、NK细胞和CTL细胞脱颗粒功能可能存在异常，这与基因检测结果相互印证。同时，由于CD107a激发实验与基因测序相比，报告结果更为迅速，且与穿孔素蛋白联合检测和NK细胞毒活性检测实验相比有更好的灵敏度和特异度，推荐作为原发性HLH的筛查实验[17]。

综上所述，本研究报告了1例由UNC13D复杂等位基因突变导致的FHL，为临床诊断提供参照。近年来，随着基因测序技术的发展，研究[18-20]发现并报道了许多HLH相关的新的基因突变，这对于新突变的解释及致病机制等的研究有重要的临床意义，同时也为疾病的精准治疗和异基因造血干细胞移植选择提供了可能。未来希望能够通过新的技术手段更好地了解HLH相关的新的基因突变和病理生理机制，进而快速诊断、精准治疗、降低疾病死亡率、提高患者生存质量。