PLA2R基因多态性与成人特发性膜性肾病治疗效果及预后的关系

宋 雪 陆 晨

膜性肾病(membranous nephropathy,MN)是常见的肾小球疾病类型之一，发病率逐年上升，成为我国继IgA肾病之后的第二大原发性肾小球疾病，且相对于继发性膜性肾病(secondary membranous nephropathy,SMN)，特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)较为常见[1-3]。IMN作为成人肾病最常见的病理类型，其临床表现多样，部分患者预后较差，治疗仍较为棘手，发病机制复杂且尚不明确。近年来，随着对IMN发病机制研究不断深入，发现IMN的发生发展与某些基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点密切相关。已有研究[4]表明，磷脂酶A2受体(phospholipase A2 receptor,PLA2R)与IMN进展有关，且其存在基因突变和基因多态性，可能是引起IMN的主要靶抗原。但是，PLA2R基因多态性与IMN治疗效果及预后的相关性研究较少。目前研究[5]认为，SNP rs35771982位点位于PLA2R基因胞外结构域中，可能影响PLA2R结构和功能。因此，本研究通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术检测本院IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位点基因型，分析其与成人IMN患者治疗效果及预后的关系，以期为IMN临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年12月新疆维吾尔自治区人民医院肾内科经肾活检确诊并治疗的60例IMN患者为研究对象，病理诊断均符合Ehrenreich-Churg膜性肾病的诊断标准[6]。其中男性35例，女性25例，均为新疆维吾尔族人；年龄18～60岁，平均(48.65±15.36)岁。同期选取60例健康体检者为对照组，其中男性31例，女性29例，均为新疆维吾尔族人；年龄18～60岁，平均(45.24±13.19)岁。两组患者基础资料比较差异无统计学意义(χ2=0.539，P=0.463；t=1.305，P=0.195)。本研究经本院道德伦理委员会批准后实施，所有样品采集均取得患者或家属知情同意并签字。

1.2 试剂与仪器 PCR扩增试剂盒(货号DR011)购自日本Takara公司；全血基因组DNA提取试剂盒(货号D1800)购自美国Santa公司；PCR产物回收纯化试剂盒(货号D6492-02)购自美国Omega公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；核酸分析仪(型号2100)购自Agilent公司；PCR扩增仪(型号C1000)、凝胶成像系统(型号Gel Doc 1000)购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集 所有研究对象抽取清晨空腹静脉血5 mL于含5% 乙二酸四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的抗凝管中。采用人全血基因组DNA提取试剂盒提取患者全血样本中的基因组DNA，具体操作严格参照试剂盒说明进行。经核酸分析仪测定DNA产物的纯度和浓度，确定其OD260/280为1.8～2.0后，将DNA稀释后分装，保存于-80℃备用。

1.3.2 PCR-RFLP技术检测PLA2R基因rs35771982位点的基因型 参照文献[7]及NCBI GenBank SNP数据库检索及比对，选择位于人类PLA2R基因Gene ID：22925(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)第5号外显子区的rs35771982位点，并应用Primer Premier 5.0软件设计扩增引物(引物序列见表1)。PCR反应体系(20 μL)：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Premix Taq 10 μL，ddH2O 6 μL；反应程序：95℃预变性4 min，95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，35个循环，72℃延伸10 min。目的基因扩增产物经限制性内切酶Bbs I酶切，37℃消化4 h，65℃ 30 min终止反应。酶切产物经3.0%琼脂糖凝胶电泳后，于凝胶成像系统中观察条带分布情况，并将PCR扩增产物进行纯化后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。采用Chromas软件分析测序结果，确定每例IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位点基因型。

表1 PCR引物序列

1.3.3 随访及观察指标 IMN组患者随访时间为12个月，随访过程中观察每例患者的血压、24 h尿蛋白定量、血清清蛋白、血肌酐、血清总胆固醇、血清三酯甘油等指标，并根据慢性肾脏病流行病学合作研究(CKD-EPI)公式计算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)。同时，记录患者在治疗期间发生的血糖、尿酸异常升高等不良反应，以空腹血糖值≥6.0 mmol/L为血糖异常，以尿酸值≥420 μmo1/L为尿酸异常，比较不同基因型间血糖、尿酸异常率。

1.4 临床疗效评价 参照《中国成人肾病综合征免疫抑制治疗专家共识(2014)》进行疗效判定[8]：①24 h蛋白尿定量<0.3 g，血清清蛋白>35 g/L，尿蛋白阴性为完全缓解；②0.3 g<24 h蛋白尿定量<3.5 g或24 h尿蛋白定量比基线水平下降50%且肾功能稳定为部分缓解；③24 h尿蛋白定量>3.5 g，且下降幅度小于基线水平的50%为未缓解；④经治疗后缓解的患者重新出现24 h尿蛋白定量>3.5 g为复发。比较不同基因型间完全、部分缓解率以及复发率，并以完全缓解与部分缓解定义为预后良好，未缓解以及复发定义为预后不良。

2 结果

2.1 IMN组与对照组PLA2R基因SNP rs35771982位点的基因型比较 测序结果显示，PLA2R基因SNP rs35771982位点存在G/C突变，有野生型纯合子GG、突变型杂合子GC、突变型纯合子CC 3种基因型。IMN组60例患者中GG 6例(10.00%)、GC 16例(26.67%)、CC 38例(63.33%)，G等位基因频率为23.33%，C等位基因频率为76.67%，且其GG基因型、G等位基因比例显著低于对照组，CC基因型、C等位基因比例显著高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 IMN组与对照组PLA2R基因SNP rs35771982位点基因型及等位基因分布比较[例(%)]

表3 IMN患者PLA2R基因 SNP rs35771982位点基因多态性与治疗缓解率的关系[例(%)]

表4 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位点基因多态性与复发率的关系[例(%)]

表5 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位点基因多态性与不良反应的关系[例(%)]

2.5 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位点基因多态性与不良预后的logistic回归分析 以本研究资料中CC、GC、GG基因型(GG型=0；GC型=1；CC型=2)、年龄(<45岁=0；≥45岁=1)、血肌酐(<186 μmol/L=0；≥186 μmol/L=1)、24 h尿蛋白定量(<3.5 g=0；≥3.5 g=1)为自变量，以预后情况(预后良好=0；预后不良=1)为因变量，进行logistic回归分析。在调整年龄、血肌酐、24 h尿蛋白定量等后，结果显示，SNP rs35771982位点CC基因型是影响IMN患者不良预后的独立危险因素(OR值=6.634，P<0.001)，相较于GG基因型，CC基因型患者预后不良的风险为6.634倍。见表6。

表6 IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位点基因多态性与不良预后的logistic回归分析

3 讨论

PLA2R基因位于人类染色体2q23-q24区，其内部包含许多SNP位点。研究[9-12]发现，PLA2R基因SNP位点及基因多态性可通过影响PLA2R抗体形成及足细胞表面PLA2R表达影响IMN的进展。目前，研究[13]证实，PLA2R基因SNP rs35771982位点突变是IMN发病的危险因素，该位点发生G/C突变后天冬氨酸取代组氨酸，导致C型钙离子依赖性凝集素结构域结构变化，PLA2R的抗原表位暴露并产生特异性抗PLA2R抗体，促进IMN发生发展，并可能影响预后。郭玉等[7]研究发现，中国新疆维吾尔族IMN患者rs35771982位点中CC基因型、C等位基因是其易感基因，也是功能基因。本研究发现，IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位点存在GG、GC、CC三种基因型，以CC基因型居多，约占63.33%，且其CC基因型、C等位基因占比显著高于健康对照组，推测中国新疆地区维吾尔族IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位点CC基因型、C等位基因可能与IMN的进展密切相关，与郭玉等[7]研究结果相一致。

Hoxha等[15]研究发现，IMN患者PLA2R抗体水平与蛋白尿达到缓解的时间具有一定相关性，其是影响IMN缓解的一个独立危险因素，可用于监测IMN的治疗效果及预后。彭佳楠等[14]研究发现，中国宁夏地区携带PLA2R基因SNP rs35771982位点GG基因型的IMN患者较携带CG/CC基因型的患者完全/部分缓解率降低，且rs35771982位点GG基因型是IMN的独立危险因素，其与疾病的预后相关。本研究发现，PLA2R基因SNP rs35771982位点CC基因型患者的完全/部分缓解率、复发率显著低于GC、GG基因型患者，而GC、GG基因型患者的完全/部分缓解率、复发率差异无统计学意义，提示IMN患者携带PLA2R基因SNP rs35771982位点CC基因型可能不利于IMN疾病的治疗，且预后较差，推测这可能与CC基因型影响PLA2R抗体水平相关。

目前，临床上多使用免疫抑制剂治疗IMN，虽然具有一定的临床疗效，但是环磷酰胺、他克莫司等免疫抑制剂带来的不良反应几乎难以避免。本研究发现，PLA2R基因SNP rs35771982位点CC基因型患者的血糖异常率GG基因型，尿酸异常率显著高于GC、GG基因型，提示IMN患者携带CC基因型可能促进血糖、尿酸等不良反应的发生，降低治疗疗效和安全性，且预后较差。进一步通过logistic回归分析发现，CC基因型是影响IMN患者不良预后的独立危险因素，表明PLA2R基因SNP rs35771982位点CC基因型的存在提高了IMN治疗的难度，并严重影响预后。

综上所述，中国新疆地区维吾尔族IMN患者PLA2R基因SNP rs35771982位点的基因多态性可能与IMN治疗效果及预后密切相关，并且rs35771982位点CC基因型是影响IMN患者不良预后的独立危险因素。本研究局限于样本含量相对较少，随访时间较短，PLA2R基因多态性对IMN患者治疗效果及预后的影响及其机制还有待进一步深入研究。