鹿茸多肽的研究进展

王 响 鞠贵春

(1.吉林农业大学中药材学院，长春，130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，长春，130118)

鹿全身是宝，鹿茸、鹿角、鹿胎、鹿骨、鹿鞭、鹿血等均是《本草纲目》与民间验方有记载的可供药用的名贵中药材和食疗补品。尤其是鹿茸有明显改善人体机能的功效，被列为动物药之首。《神农本草经》中曾有记载“味甘温，主漏下恶血，益气强治补血之功，补肾之效。”《本草纲目》中亦有记载“补肾壮阳，生精益血，补髓健骨”。我国对鹿茸的研究具有悠久的历史，很早之前，人们对鹿茸的药理作用不断地进行探讨，对鹿茸的多种药理活性成分进行了分离，确定了鹿茸中含有蛋白多肽、甾体化合物、无机元素、多糖、脂肪酸、磷脂、胺类、生物碱和脂多糖等多种有效成分[1]，其中鹿茸多肽类物质含量在50%以上，包含多种生长因子，可促进人体多种生长因子分泌，对人体的一些生理功能具有调节作用，具有显著的药理作用和保健功效。

1 鹿茸多肽的研究现状

赵丽莉[2]利用Alcalase AF 2.4L碱性蛋白酶酶解马鹿茸生成多肽，并且通过不断优化酶解条件从而选取出马鹿茸酶解的最佳工艺。采用Tricine凝胶系统对马鹿茸酶解后多肽分布进行分析，得出结论：马鹿茸酶解前分子量主要分布在10—75 kDa，马鹿茸酶解后分子量主要分布在5—2 kDa。郝林琳[3]从新鲜马鹿茸中提取活性多肤，SDS-PAGE显示其为一系列分子量低于17 kDa多肽混合物，检测到其含有IGF-1、EGF、NGF等生长因子。Zhang等[4]从梅花鹿茸中提取出一种分子量为7.2 kDa，由68个氨基酸组成的水溶性多肽活性物质，具有刺激软骨生长，成骨样细胞增殖的作用。柯李晶等[5]从梅花鹿鹿茸中分离出分子量为153 kDa，能够促进神经纤维生长活性的鹿茸多肽。段冷昕[6]从马鹿茸中分离出一种分子量为3.2 kDa的单体多肽，由32个氨基酸残基组成，又称为32肽，其中含量最多的氨基酸分别为缬氨酸，赖氨酸、甘氨酸和丙氨酸，具有抑制细胞内IL-6，IL-1因子的功能。

2 鹿茸多肽的提取方法

鹿茸多肽的提取方法有很多种，常用的提取方法主要有以下几种。

2.1 有机溶剂萃取法

在中药提取方面，是最常用的方法，通常采用乙醇、丙酮、乙醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂提取。本方法的优点是毒副作用小，溶剂易获得，成本低，回收方便。缺点是有机溶剂对鹿茸多肽活性具有一定的破坏作用。有机溶剂熔点低、易燃，操作过程对温度要求严格，控制难度较大，本方法可将鹿茸提出物分为鹿茸多肽组分Ⅰ和组分Ⅱ，这两种组分均具有抗炎和促生长的作用[7]。

2.2 CO2超临界萃取法

本方法利用减压和变温使提取物分离出来，无须回收溶剂，节约能耗，操作简单，成本低，可循环利用。但是随着萃取化合物的极性基团增多，萃取难度加大，化合物的相对分子质量越高，萃取难度也增大。在鹿茸提取上具体就是将鹿茸冷冻后干燥，用粉碎机粉碎过筛，提取鹿茸多肽时，首先将鹿茸冷冻干燥，粉碎过筛后放入CO2超临界萃取。在萃取压力35 MPa，萃取温度40 ℃以下时蛋白质的萃取率可达130.73 mg/g[8]。

2.3 酶解提取法

本法可弥补有机溶剂萃取法的不足，解决了低温控制难的问题，提取的鹿茸多肽活性高、纯度好。将鹿茸冷冻干燥，粉碎后加入盐酸胍和胃蛋白酶抑制剂浸提，离心取上清液，加入硫酸铵进行蛋白梯度盐析，离心后的沉淀物进行复性，用透析袋截留，冷冻干燥后得到水溶性蛋白，然后利用胃蛋白酶、胰酶、氢氧化钠和盐酸溶液调节酶的pH，获得不同分子量的鹿茸蛋白水解肽，采用的酶不同，鹿茸多肽获得率也不同[9]。

2.4 Tris-Hcl法提取法

将鹿茸鲜品剃毛切薄片，冲洗后称重，反复匀浆，匀浆过程中不断添加匀浆液(Tris-Hcl缓冲溶液，pH 8.0)，4 ℃条件下离心后取上清液。除盐后冻干，得到鹿茸蛋白质粗提物，在-20 ℃保存。缓冲液pH值、温度与提取时间影响提取率。此提取方法简单易操作，节省时间，成本低，但pH值易受温度影响[10]。

2.5 超声波提取法

通常以水、醋酸缓冲溶液、碱性碳酸盐缓冲溶液或磷酸缓冲溶液为溶剂，将鲜鹿茸洗净、去毛、切片、粉碎后脱脂，根据不同需要加入不同的提取液，在特定温度下超声浸提一定时间，然后离心取上清液，透析后冷冻干燥。此提取方法的优点是操作时间短，成本低，操作简单安全性高，可有效提高鹿茸多肽的提取率[11]。

2.6 高压电场法提取法

利用分子在高压电场条件下产生极化反应，利用电场瞬间高强度的脉冲来破坏细胞壁，使细胞内容物释放出来。姜薇等[12]利用高压脉冲电场辅助菠萝蛋白酶制备鹿茸抗氧化肽，并进行了分离纯化。此提取方法常温提取，耗时短，可最大限度地保留鹿茸多肽的生物活性，节能无污染。

2.7 匀浆法

取新鲜鹿茸洗净后切块粉碎，浸泡冲洗至无色，用预先放于层析柜(4 ℃)中冷却加入预冷的匀浆液(冰醋酸溶液)，胶体磨匀浆，间隔一定的时间吸取混合匀浆液，在4 ℃条件下，转速离心后吸取上清液，放入透析袋中透析脱盐，定时更换透析液并测量pH，直至pH为中性停止透析，透析袋内液体为所需蛋白。此提取方法的优点是随着匀浆时间的增加，鹿茸多肽的浓度增加。但是与超生提取法相比，耗时较长[13]。

3 鹿茸多肽的药理作用

3.1 对骨骼的药理作用

刘继华等[14]研究发现，对骨折小鼠注射鹿茸多肽会使小鼠骨折愈合速度明显加快，鹿茸多肽使骨髓腔充满大量骨髓细胞，骨性连接更加稠密，抗骨折能力增强。李文超等[15]发现鹿茸多肽对白介素-1β诱导的大鼠椎间盘软骨终板细胞的增殖和基质蛋白、基质降解酶的基因表达具有逆转作用。并且能有效地拮抗白介素-1β对软骨终板细胞增殖的抑制作用，上升Ⅱ型胶原蛋白基因的表达，下调Ⅹ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶-13基因的表达具有延缓椎间盘软骨终板退变的作用。Zhang等[16]研究证实马鹿茸多肽显著逆转了去卵巢大鼠的骨质疏松症，改善了骨重量系数、骨矿物质密度、矿物质含量和微结构，抑制了白介素1与白介素6的活化，同时发现鹿茸多肽还具有促进软骨细胞和成骨细胞增殖的作用。

3.2 对心肌细胞的药理作用

徐岩等[17]研究表明，鹿茸多肽可促进心肌干细胞基因和心肌肌球蛋白重链基因的表达，通过调节氧化酶的活性，促进过氧化物的分解，对心肌干细胞分化成心肌细胞具有促进作用。现代研究表明[18]鹿茸多肽对大鼠心肌缺血性损伤有保护作用，在一定剂量范围内可显著减少因心肌缺血而造成的心肌梗死面积。鹿茸多肽具有提高血清和心肌组织中的超氧化物歧化酶的活性，降低血清中肌酸激酶、乳酸脱氢酶、天门冬氨酸氨基转移酶和心肌组织中丙二醛的含量的作用，鹿茸多肽在心肌损伤性疾病的康复中有比较好的治疗价值。

3.3 抗炎症作用

炎症与体内血清中的丙二醛，超氧化物歧化酶和炎症因子NO的含量有关，鹿茸蛋白水解肽可通过载体运输和旁路运转的方式被小肠上皮吸收利用。已有研究证实[19]：鹿茸多肽可有效抑制肠炎、风湿性关节炎等急慢性炎症，对哮喘和动脉粥样硬化也具有抑制作用。Dong等[19]认为鹿茸多肽对椎间盘髓核细胞原代培养有积极影响，显著抑制由脂多糖诱导髓核细胞而产生的炎症因子，包括白细胞介素-1β，肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6。鹿茸肽还会抑制由脂多糖诱导的丙二醛的增加和超氧化物歧化酶的减少，并且减少脂多糖对机体的攻击，对抗椎间盘髓核细胞原代培养中脂多糖介导的炎症。王昊天[8]采用CO2超临界提取法和酶解法得到多种分子量不同的多肽，对抗炎效果进行了评估，认为鹿茸肽抗炎效果是多种肽共同作用的结果。Lee等[20]采用碱性蛋白酶酶解鹿茸粉得到了具有抗机体炎症效果的鹿茸多肽，并证实鹿茸多肽会抑制炎症介质如一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)的表达。赵磊等[9]研究发现鹿茸水解蛋白肽更容易被小肠上皮细胞吸收，并且可显著降低NO含量，增加血清中超氧化物歧化酶的含量，改善机体内的氧化应激状态，抗炎效果较好。这些研究结果表明鹿茸多肽可作为具有抗炎作用的潜在天然药物。

3.4 抗氧化作用

机体的氧化机制与机体的衰老机制相关，据刘春娟[21-22]研究证明，鹿茸多肽增强超氧化物歧化酶活性，清除体内过多的氧自由基的作用，在延缓衰老方面有显著的功效。利用膜分离技术从鹿茸中分离出不同分子量的多肽并与维生素C为对照，比较不同分子量的多肽的抗氧化能力，结果表明分子量在6 214 μ以下的多肽在8.0—10.0 mg/mL的浓度下对羟基自由基的清除能力和对脂质体氧化抑制的能力明显高于维生素C。

3.5 抗疲劳作用

已有研究证明[23]鹿茸多肽可提高人体内肌糖原和肝糖原的储备量，或者是减少在运动过程中体内肌糖原和肝糖原的损耗，由此两种途径延长糖在体内代谢的时间从而达到抗疲劳作用，并且随着鹿茸多肽剂量的增加，抗疲劳的作用越明显。

3.6 对肝脏的药理作用

肝纤维化是很多肝脏疾病的诱因，肝窦状毛细血管化是肝细胞纤维化过程中的一个重要的病理改变，鹿茸多肽具有调解人体肝细胞，改善肝损伤，提高肝脏功能，从而能够保护人体肝脏。鹿茸多肽能够促进肝细胞再生，修复肝细胞损伤[24]。段冷昕[6]利用大鼠肝纤维化模型，观察发现鹿茸肽可减轻肝窦毛细血管化，改善肝脏微循环，减轻肝纤维化病变，通过提高机体内对自由基的清除程度，保护肝脏的细胞，在肝脏疾病的治疗中作用明显。

3.7 促进皮肤创口愈合

在临床上皮肤创伤常见，包括烧伤、烫伤、划伤等导致皮肤表面出现破损，鹿茸多肽作为鹿茸含量丰富的活性物质，对人体组织间细胞的生长有促进作用。牛琼等[25]利用鹿茸多肽治疗大鼠背脊创口，发现鹿茸多肽可促进皮肤创口愈合，作用机制是促进表皮细胞和成纤维细胞的分裂，鹿茸多肽在对皮肤创口治疗过程中外敷给药的效果要比注射给药效果显著。

3.8 对神经系统作用

Bai等[26]认为鹿茸多肽在体外对神经干细胞分化为神经元细胞的过程有明显促进作用。Zhang等[4]证明，鹿茸多肽-聚乳酸聚羟基乙酸复合膜能够提供神经修复所需要的微环境，而鹿茸多肽作为其中必不可少的神经营养因子可促进周围神经再生。魏延云等[27]认为鹿茸多肽对大鼠坐骨神经损伤，具有促进神经再生、加快神经轴生长作用。朱文赫等[28]认为鹿茸多肽可对抗神经性药物对小鼠记忆的损伤以及微波辐射对小鼠神经细胞的损伤，对小鼠的记忆巩固和记忆修复有促进作用。

3.9 其他作用

徐岩等[29]认为鹿茸多肽对人胶质瘤细胞的增殖有抑制作用，二者之间有一定的量效关系，在肿瘤细胞的G2/M期阻滞肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。黎同明等[30]研究证明，鹿茸多肽对生殖系统也有显著作用，鹿茸多肽可提高雄鼠腺垂体细胞分泌的黄体生成素和睾酮的含量，对阳痿和性功能障碍有一定的治疗作用。 Zang等[31]研究证实鹿茸多肽可使老化的雄性小鼠的性功能显著改善，鹿茸对性功能的影响是通过促进几种合成睾酮的限速酶的表达从而促进体内睾酮合成。Zhu等[32]研究证明从鹿茸中分离出7.0 kDa的多肽可明显增强人静脉内皮细胞的活力，减少细胞凋亡，逆转线粒体膜电位去极化，抑制氧化应激，证明了鹿茸多肽在治疗心血管疾病的前景。Zhao等[33]证实鹿茸肽可通过阻断TGF-β1信号传导来防止心脏纤维化，在心脏组织中鹿茸肽具有抗纤维化作用。

4 小结

我国目前已经具有了较为成熟的鹿养殖和鹿产品加工技术，多种分离纯化方法都能够提取鹿茸多肽，但是每一种分离提纯方法都有一些不足的问题，还需要探索一种更有效、更快速、对成分活性损伤小的分离纯化技术，在制剂工艺和给药途径上还需进一步规范。鹿茸多肽的作用机理还需要进行研究，如何能保证多肽分子在未起作用之前不失活。随着鹿茸多肽在人类生活中广泛的应用，对鹿茸多肽类产品质量控制方法和毒副作用还需要研究。在药品用药安全方面和药理作用方面还需进一步研究。