间充质干细胞来源的细胞外囊泡在炎症性肠病中的研究

楚 思，范 恒

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，湖北 武汉 430022

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种慢性、特发性的肠道炎症性疾病，临床表现为反复发作的腹痛、腹泻、血便，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)[1]，近年来IBD在亚洲的发病率持续增加[2]。目前IBD的发病机制尚未完全明确，但归因于多种因素，包括遗传易感性、肠道微生物组的改变、先天和适应性免疫系统的缺陷及各种环境暴露。

目前对IBD的药物治疗主要包括5-氨基水杨酸酯类药物、类固醇、抗微生物制剂、免疫调节剂和单克隆抗体[3]。但传统疗法频繁地显现出各种不良反应及耐药性，寻找替代疗法成了迫切需要。近年来，随着医学的发展，已经应用人类干细胞疗法来治疗包括IBD在内的组织相关性疾病。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是其中应用最广泛的细胞，具有公认的促进受损组织再生和调节免疫反应的能力，因其活跃的增殖和多向分化的潜能，并且能触发强大的免疫调节和自身的低免疫原性，确保了他们在再生医学和免疫干预疗法方面的成功[4]。研究表明，MSCs治疗作用的潜在机制除了其定向迁移分化的能力外，更重要的在于其旁分泌作用，除了分泌细胞因子和生长因子，还释放细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，这些EVs在组织再生和免疫调节中扮演着重要的角色[5]。本文将对MSCs来源的EVs(MSC-EVs)在IBD中的作用作一概述。

1 MSC-EVs

MSCs是成纤维细胞样祖细胞，最初在骨髓中发现，可以从骨髓、脂肪、脐带等不同组织中获得，可分化成多种不同类型的细胞。研究发现，MSCs不表达人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类抗原，导致MSCs在同种异体移植中具有较低的免疫原性[6]。因此MSCs成为再生医学和免疫疗法中非常重要的细胞来源。最初，人们将MSCs的治疗作用归因于它们能够迁移并定植到靶向区域的能力，但许多干细胞移植的研究显示到达靶区域的MSCs数量很有限[7]，且MSCs的无细胞条件培养基和MSCs的分泌组对多种疾病显示出有益作用[8]。这强烈提示MSCs介导的治疗作用可能归因于它们的分泌途径而不是其组织归巢能力。

EVs是由细胞分泌的纳米级别的膜性小体(大小范围为30～1 000 nm)，是在细胞之间穿梭的能够维持机体生理稳态及影响疾病发生[9]的重要生物分子[10-11]，根据来源及形成方式的不同可分为微泡、外泌体和凋亡小体[12]。EVs可以与靶细胞膜融合以释放其内含物，包括miRNA、mRNA、生长因子等进入靶细胞，这被认为是它们的关键生理功能[13]。同时，EVs可能通过细胞因子的分泌或促进炎症介质的表达来发挥免疫调节作用[14]。

研究表明，MSC-EVs在中风[15]、脑外伤[16]、伤口愈合[17]等动物模型中能够促进再生并具有抗炎特性。最近的研究表明，MSC-EVs发挥的生物学作用与母体细胞相当[18]，在许多疾病中均展现了与MSCs类似的治疗作用[19-20]。使用MSC-EVs作为MSCs的替代品具有多项优点，EVs能够穿透多种生理屏障[21]。此外，使用MSC-EVs可避免干细胞导致的一些并发症——异位肿瘤形成、肺微血管内陷等。这些优势均表明MSC-EVs是一种值得发掘的治疗手段。

2 MSC-EVs调节IBD肠道免疫

肠道适应性免疫和固有免疫功能缺失或异常在IBD的发病中起关键作用。过去，大多数研究集中在适应性免疫失常在IBD中的作用。近期全基因组关联研究(GWAS)和免疫学研究取得进展，发现肠道黏膜固有免疫异常在IBD患者中普遍存在。

2.1 MSC-EVs调节肠道固有免疫巨噬细胞已被确定为诱导结肠炎症最关键的细胞，能够在受损的上皮细胞中释放大量与损伤相关的分子模式(DAMP)以激活结肠巨噬细胞中的NF-κB信号通路，从而导致一氧化氮合酶(iNOS)的表达和炎性细胞因子的分泌增强，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β、一氧化氮(NO)、淋巴细胞和单核细胞招募趋化因子(CCL-17和CCL-24)[22]。巨噬细胞源性TNF-α和IL-1β诱导增强E和P选择素在内皮细胞上的表达使循环单核细胞大量流入受损肠道内的淋巴细胞。巨噬细胞来源的CCL-17和CCL-24吸引促炎M1巨噬细胞，并产生分泌IFN-γ的CD4+Th1细胞，间接促进结肠损伤和肠道炎症。在接受MSC-EVs治疗的DSS小鼠的肠道中，巨噬细胞来源的炎性细胞因子和趋化因子(TNF-α、CCL-17和CCL-24)和Th1分泌的IFN-γ的表达明显减弱。体外实验证实了MSC-EVs进入了脂多糖(LPS)激活的结肠巨噬细胞中，抑制了炎症细胞因子的产生，并且诱导免疫抑制M2表型的产生[23]。MSC-EVs在抗炎性M2表型中诱导结肠巨噬细胞极化，表现为免疫抑制细胞因子TGF-β和IL-10的分泌增加，促进了Treg细胞的增殖。此外，MSC-EVs还通过抑制结肠巨噬细胞中的IL-7信号传导在结肠炎中发挥有益作用。由此可知，MSC-EVs治疗显著降低了结肠巨噬细胞中IL-7和iNOS信号通路的活化，导致TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌减少而IL-10的分泌增加，从而减轻结肠炎症[24]。

树突状细胞(dendritic cells，DC)是专业的抗原提呈细胞，负责T细胞活化和诱导适应性免疫反应，是固有免疫和适应性免疫之间关联的关键参与者。DC通过细胞间通讯和细胞因子的分泌途径来发挥免疫调节作用。IL-12在幼稚T细胞分化的抗原提呈过程中发挥重要的诱导免疫反应的作用。IL-12主要通过STAT4诱导T细胞IFN-γ产生，而DC是IL-12的关键生产者之一。有研究发现，MSC-EVs处理后的DC分泌的IFN-γ减少，这将引起Th1和Th2效应T细胞的平衡变化[25]。在体外实验中，DC的CCR7表达和向CCR7的配体CCL-21迁移的能力下降，这表明经过MSC-EVs处理的DC可能由于无法向次级淋巴组织迁移导致体内炎症性T细胞反应受到抑制，相反，促进Treg的增殖，发挥免疫抑制作用。

2.2 MSC-EVs调节肠道适应性免疫适应性免疫反应由淋巴细胞(T细胞和B细胞)组成，当其激活后产生细胞因子和抗体。为了清除特定的抗原，Th0被激活，分化成Th1、Th2或Th17细胞，然而T细胞的反应异常伴T细胞亚群的过度发育可导致炎症的发生。

Th17是T细胞的子集，可以产生大量的IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22。Th17细胞和它的标志性细胞因子IL-17A在肠道炎症中广泛研究。研究发现，IBD患者的肠道黏膜中IL-17A的表达水平更高，且IBD患者的结肠固有层含有更多的Th17和Th1/Th17细胞[26]。由此可知，Th17的过度激活是IBD发病的关键因素。Chen等[27]发现，TNBS诱导的结肠炎大鼠的脾脏及肠系膜淋巴结中，Th17细胞的比例显著增加，而经骨髓MSCs分离的EVs治疗后，Th17的比例明显降低。这表明MSC-EVs对TNBS诱导的Th17活化具有显著的抑制作用，从而能够缓解实验性结肠炎大鼠的症状，MSC-EVs的调节作用可能与H3K27me3的甲基化和去甲基化不平衡有关。

Treg是CD4+T细胞的亚群，能够特异性表达Foxp3，Treg通过抑制异常的免疫反应，在维持肠道黏膜稳态中发挥重要作用。Treg通过产生抗炎细胞因子IL-10和TGF-α，以及通过抑制逃脱了其他免疫耐受途径的T细胞的增殖和活化来发挥其功能。研究发现，Treg在实验性结肠炎中发挥抗炎作用，且与缓解期IBD患者相比，活动期IBD患者的外周血中几乎无Treg。IBD的发病可能与Treg数量减少有关。Du等[28]将MSC-EVs与外周血单核细胞(PBMCs)共培养，发现MSC-EVs可以上调PBMCs中抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1的表达能力，从而促进Treg细胞的增殖和免疫抑制功能。

3 MSC-EVs减轻肠道上皮凋亡

肠道屏障除了参与消化与吸收营养外，还构成了固有免疫系统的一部分，阻止了潜在有害抗原和微生物的入侵。肠道屏障缺损与多种疾病有关，包括IBD、结肠癌等。肠道通透性的相关研究表明，IBD患者肠道通透性较正常增加40%～50%，且肠道屏障缺损可能是IBD患者的早期症状之一[29]。肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IEC)通过紧密连接形成了肠道屏障，IEC具有强大的自我更新能力，从而维持肠道屏障的完整性。研究发现实验性结肠炎小鼠的肠上皮细胞凋亡增加，如Nenci等[30]发现，缺乏NF-κB基因的小鼠产生慢性肠炎的几率增加，NF-κB是参与IEC功能的关键分子，这些小鼠由于该基因的缺失导致肠上皮凋亡增加，从而导致肠屏障的破坏。同时，有研究证明从UC患者的结肠活检中发现大量的凋亡小体[31]。综上所述，推测IEC的细胞凋亡途径在IBD的发病中起重要作用。

MSC-EVs可以通过减轻上皮细胞凋亡从而缓解IBD的症状。Yang等[32]发现，TNBS诱导的结肠炎大鼠结肠黏膜中caspase3、caspase8、caspase9的表达明显升高，而经MSC-EVs尾静脉注射的大鼠结肠黏膜中c-caspase9、c-caspase8和c-caspase3的表达显著降低。外在凋亡的发生取决于caspase8和caspase3的激活，caspase9则参与内在凋亡途径。由此可知，MSC-EVs可以抑制肠道上皮细胞的凋亡。

4 MSC-EVs作为药物递送的载体

EVs被认为是非免疫原性的纳米囊泡，可以保护其内容物免受血清蛋白酶和免疫系统的影响，从而传递信息并与其他细胞通信[33]。与其他合成的纳米颗粒，如脂质体不同的是，外泌体含有跨膜和膜锚定蛋白，使得其内吞作用增强，从而有利于内容物的运送[34-35]。广泛的研究已针对利用外泌体作为各种疾病的治疗传递物，使用外泌体本身或工程外泌体来增加特定药物的稳定性，可增强靶向性和装载效率。MSC-EVs在安全性方面具有优势，因为它们被认为是非免疫原性的，可以降低同种异体宿主免疫排斥的风险。此外，外泌体可以通过内皮层进行胞吞转运来穿越血脑屏障以运送生物分子到脑实质。与大多数纳米药物载体一样，外泌体主要聚集在肝脏、肺脏和脾脏，但它们同样也对自身来源的组织具有亲和力。Keener[36]发现，从纤维肉瘤细胞收获的外泌体被注射到荷瘤小鼠中后，这些囊泡被吸引到了肿瘤组织。这种归巢特征意味着外泌体可以将更多的药物运送到需要的部位，减少了潜在的不良反应。且该研究表明，用囊泡包裹的阿霉素同样可以使肿瘤缩小，且效果优于单独使用的药物。除了天然外泌体外，还可以制备工程外泌体，如用电流或化学方法将需要装载的治疗药物包裹进囊泡中，如RNA、蛋白质等。研究人员确定了天然外泌体的RNA中可能负责包装的代码片段，发现复制这些编码片段后外泌体的负载量增加了100倍，并计划使用这项技术来制备包裹有阻断血管形成的miRNAs的外泌体，来防止乳腺癌患者的癌细胞扩散。此外，外泌体在体内的耐受性良好，因其为内源性的生物纳米囊泡，具有优异的生物相容性。因此，外泌体可以作为安全有效的纳米载体。

5 展望及临床使用存在的问题

MSC-EVs在损伤修复和免疫调节中的作用使其成为一种极具吸引力的治疗方法，且其在体内循环中稳定，具有明显的归巢特性，并且能够穿越生物屏障，同时又避免了肿瘤形成等细胞治疗的隐患，更具安全性。由于它们具有较高的稳定性，在机体循环中能够达到足够的检测浓度，根据其含有的蛋白质和RNA能够追溯到母体细胞，因此EVs又可以作为疾病诊断的生物标志物。目前关于MSC-EVs在IBD治疗中的研究还较少，但其强大的免疫调节功能及作为纳米载体的优势，使其在IBD治疗中的前景让人期待。

MSCs的未来还有许多值得探索的地方，接下来会出现大量相关的研究，而MSC-EVs将在其中占有主导地位。MSC-EVs的作用与MSCs类似，同时又避免了细胞治疗的弊端，这为将来的生物疗法提供了新的思路。尽管MSC-EVs在临床前研究中取得了成功，但在临床环境中使用这些EVs仍有一些问题需要解决：(1)大量生产、分离及储存的方法，以及如何进行稳定的冷链运输；(2)精准地对囊泡进行定性、定量；(3)给药方式、次数及剂量；(4)供体和组织来源的选择等。这些问题正在逐渐地解决，如生产分离方式正在逐步优化，此外还需要开展更加深入的研究，才能早日实现临床应用。