外泌体参与肝脏疾病的研究进展

叶倩伶，龙富立，毛德文，王明刚

1.广西中医药大学，广西 南宁 530222；2.广西中医药大学第一附属医院肝病科

外泌体近年来一直是学者们非常感兴趣的医学研究话题。它们调节细胞-细胞间通讯和参与各种细胞的生理病理事件，可以使供体细胞转移到受体细胞并激活和调节细胞活性蛋白质的表达、增殖和分化等重要反应。随着研究的深入，发现外泌体具有更重要的作用，如细胞信号传导、基因调控、免疫调节等。越来越多的文献表明，外泌体参与了肝脏疾病的发生、发展，介导的细胞间通讯可以改变肿瘤生长、细胞迁移、抗病毒感染、抗纤维化和肝细胞再生等，可能对肝脏疾病具有潜在的诊断和治疗作用，是肝脏疾病诊治的潜在生物标志物。现就外泌体在肝脏疾病发生、发展中的作用作一概述。

1 外泌体简介

外泌体是天然脂质膜封闭的囊泡，直径为30～150 nm，密度为1.13～1.19 g/ml，通过透射电子显微镜观察到的外泌体通常是具有凹面的碟形或半球形，是细胞经过“内吞-融合-外排”等过程形成。外泌体可以在一系列真核液体中找到，如血浆、尿、脑脊液、唾液、母乳、羊水、支气管肺泡灌洗液等，可由多种细胞分泌，如肥大细胞、树突细胞、T 细胞、B 细胞、干细胞、星形胶质细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、上皮细胞等[1-3]。外泌体参与DNA、RNA和蛋白质的细胞间信号传导[3]，携带多种分子，包括脂质、蛋白质和核酸[4-5]，具有几种不同的表面分子，能够激活细胞受体，使其能够参与细胞之间的物质交换(即蛋白质、脂类、碳水化合物和病原体)[6]。

2 外泌体功能

外泌体曾被认为是体内的代谢废物，然而现在它们已成为调节或介导多种细胞过程的重要细胞间通讯载体，外泌体的释放目前被认为是细胞间通讯的整体机制，其可能影响相邻细胞和远端细胞，具有独特的组织/细胞类型特异性蛋白质，可反映其细胞来源[7]。外泌体的产生和释放机制非常复杂，涉及多种因素，如四跨膜蛋白(CD9、CD63 和 CD81)，热休克蛋白(Hsp 60、Hsp 70 和 Hsp 90)，生物相关蛋白(Alix 和 TSG 101)，膜转运和融合蛋白(GTPases、膜联蛋白和 Rab 蛋白)，核酸(mRNA、miRNA、长链非编码RNA和DNA)，以及脂质(胆固醇和神经酰胺)等[8-9]。在免疫系统中，外泌体已经被证明在介导适应性和先天性免疫应答中起关键作用，通过传播MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ分子相关的抗原来参与抗原呈递。例如，B-淋巴细胞和树突状细胞(DC)来源的外泌体刺激 T 细胞并启动宿主免疫反应[10-11]。由外泌体递送的病毒在其中释放并复制，从而产生影响宿主免疫细胞病毒的系统分布[12]。与病毒感染的细胞相似，细菌感染的细胞，如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或鸟分枝杆菌感染的巨噬细胞释放含有病原体衍生抗原的外泌体，其在细胞内细菌感染期间的免疫监视中具有重要作用[13]。

3 外泌体在各类肝病中的作用

肝脏是人体最大的内脏器官，在新陈代谢、解毒、消化、合成、存储等方面起着重要的生理作用。外泌体在肝脏主要从三种类型的细胞释放：肝细胞，非实质免疫细胞(如Kupffer细胞、自然杀伤细胞、T细胞和B细胞)和非实质肝细胞(如肝脏星状细胞)[14]。肝细胞释放或接收外泌体，用于健康和受损肝脏的细胞间通讯[15]。正常肝细胞产生的外泌体携带各种分子，如蛋白质(糖蛋白、脂蛋白和其他物质)和大量的miRNA。由于外泌体的数量和组成的改变反映了供体细胞的生理病理状态，因此外泌体介导的细胞间通讯在正常肝脏和疾病过程中也是重要的。

3.1 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)HCC是一种常见的恶性肿瘤，全球总生存率低，手术是最有效的治疗策略，但超过80%的患者在确诊时就失去了机会。因此，迫切需要找到新的抑制转移和复发的治疗方法，进行更有效的全身治疗。外泌体携带功能活跃的蛋白质、RNA 和其他类型的分子，并与癌症的病理学有关[16]。癌细胞分泌的外泌体可以在细胞存活、凋亡、迁移和侵袭中发挥重要作用。Li等[17]研究表明，外泌体可以将长链非编码 RNA(lncRNA)FAL1转移到 HCC 细胞，促进细胞生长、增殖、迁移和侵袭。Wang等[18]研究结果表明，HCC细胞 HepG2 衍生的外泌体可被脂肪细胞主动内化并引起显著的转录组学改变，特别是诱导脂肪细胞中的炎性表型。肿瘤外泌体处理的脂肪细胞能促进肿瘤生长，增强血管生成，并在小鼠异种移植模型中募集更多巨噬细胞。Liu等[19]研究结果表明，内质网(ER)应激的 HCC 细胞通过将外泌体miR-23a-3p 传递给巨噬细胞并随后增加 PD-L1 表达以促进免疫逃逸来下调巨噬细胞。Chen等[20]证明，高转移性 MHCC97H 细胞的外泌体可以被低转移性 HCC 细胞摄取并随后促进受体细胞的恶性行为。这些结果确定了肿瘤来源的外泌体在通过信号传导促进上皮细胞向间质细胞转变(EMT)过程中的可能作用，进一步促进HCC的侵袭和转移。Zhou等[21]表示，一方面肿瘤细胞通过外泌体影响邻近细胞并建立致瘤微环境，另一方面基质细胞和免疫细胞可以影响肿瘤细胞通过外泌体促进或预防肿瘤发生。通过外泌体交换RNA和蛋白质不仅可以在HCC发病和进展中起关键作用，而且可以代表潜在的非侵入性生物标志物及治疗靶标的来源，鉴定出HCC复发和预后的特异性和敏感性生物标志物。

3.2 病毒性肝炎在病毒感染中，外泌体参与传播病毒、免疫调节、抗病毒反应和操纵微环境，在病毒性肝炎发病机制中发挥重要作用。甲型肝炎病毒(HAV)是嗜肝性正链 RNA 病毒。HAV 感染偶发性地发生在全世界的流行病中，引起中度至重度急性肝脏炎症，但不能建立持续性感染。已有研究证明，eHAV负责病毒的传播和浆细胞样树突状细胞(pDC)的激活[22]。eHAV 可以通过外泌体从HAV衣壳体的内体出芽进入细胞内多泡体(MVB)[23]。乙型肝炎病毒(HBV)是一种包膜 DNA 病毒，持续感染导致慢性乙型肝炎(CHB)并增加终末期肝病的风险。干扰素-α(IFN-α)诱导的抗病毒反应可以通过外泌体从肝脏非实质细胞传播到HBV感染的肝细胞[24]。从CHB患者血清中分离的外泌体含有 HBV 病毒成分，其在原始肝细胞和 NK 细胞中诱导活跃的 HBV 感染[25]。丙型肝炎病毒(HCV)是一种嗜肝性包膜病毒，携带单链正义 RNA 基因组，感染是相关性肝硬化进展为HCC的主要危险因素。HCV 感染和复制通过肝细胞中的miR-192上调来增加 TGF-β1 mRNA的表达[26]。外泌体 miR-192 通过 TGF-β1刺激不仅刺激LX-2肝星状细胞系(HSCs)的转分化，并刺激人原代 HSCs 向肌成纤维细胞的转分化[27]。Devhare等[28]报道，HCV感染的肝细胞释放外泌体miR-19a促进HSC活化最终引起肝纤维化和其他慢性肝病。Bukong等[29]证明，HCV感染患者的外泌体不仅具有复制病毒 RNA，还增加了释放外泌体 miR-192和 miR-122水平的能力。HCV感染的肝细胞的外泌体除 TGF-β外还可含有其他抑制因子，其中包含好的病毒因子，如HCV核心和包膜蛋白[30]。当暴露于感染的肝细胞分离的外泌体时，肝脏存活的pDC产生Ⅰ型干扰素(IFN)，从Ⅰ型或Ⅲ型IFN刺激的肝内皮细胞分离的外泌体可以抑制感染肝细胞中的HCV复制[31]。戊型肝炎病毒(HEV)可引起急慢性肝炎。HEV颗粒通过MVB 转移和释放，外泌体阻滞剂可以显著降低从细胞释放的HEV颗粒水平[32]。这些发现表明，病毒感染和抗病毒反应都是通过外泌体的细胞-细胞通讯介导的，这取决于病原体和靶细胞的类型。因此，外泌体可以被用作抗病毒或疫苗的候选者。

3.3 肝纤维化肝纤维化是由肝脏持续慢性损伤后不溶性胶原和细胞外基质(ECM)成分过量产生和积累引起的，各种慢性肝病都会导致肝纤维化，甚至成肝硬化。HSCs的激活是导致肝纤维化发展的中心事件[33]。外泌体不仅可以促进肝纤维化的发展，而且还可以引发纤维化消退。来自健康人体的外泌体可能对肝纤维化患者有益，其修复受损肝脏的主要机制可能是旁分泌因子的释放[34]。这些外泌体穿过细胞间隙，在不同肝细胞之间传递“治疗分子”，致使胶原酶活性升高，活化的肌成纤维细胞凋亡及促炎细胞因子和促纤维化细胞因子的减少，最终导致 ECM 产生减少和肝纤维化消退。Chen等[35]发现，来自健康供体的血清外泌体具有抗纤维化特性，其部分归因于在活化的 HSCs或受损的肝细胞中具有治疗作用的特定miR成分。但来自受损肝细胞的外泌体富含细胞色素 P450，细胞色素 P450 2E1(CYP2E1)产生的活性氧可以产生超氧阴离子自由基、过氧化氢和强氧化剂，CYP2E1水平在各种病理生理条件下升高通过氧化应激机制导致肝细胞凋亡[36]。因此，推测含有 P450 的受损肝细胞来源的外泌体参与脂肪变性的发展，增加纤维蛋白的表达和肝细胞凋亡。受损肝细胞释放的外泌体含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和分化簇(CD)40配体，诱导炎症型巨噬细胞的产生[37]。肝细胞脂毒性脂肪酸损伤产生富含 miR17-92 簇的外泌体，它们被HSCs吸收，导致纤维化激活[38]。来自 CCl4处理的肝细胞的外泌体包括不同类型的自身RNA并识别Toll样受体3的激活剂，其增加肝γδT细胞中 IL-17的产生，促炎性细胞因子水平的增加与HSCs活化密切相关[39]。IL-17产生的T细胞调节 Kupffer 细胞中 TGF-β1，可直接激活HSCs[40]。从上皮细胞释放的外泌体可以激活成纤维细胞引发纤维化。例如，受损的上皮细胞产生的外泌体被邻近的成纤维细胞吸收，导致α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白的产生增加从而驱动肝纤维化[41]。

3.4 酒精性脂肪性肝病(ALD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)ALD和NAFLD被认为是肝纤维化的主要驱动因素。随着生活水平的不断提高，ALD的发生比例逐年升高。除传统的免疫细胞、炎性因子外，来源于外泌体中的各类蛋白质分子及miRNA 分子也是参与ALD发生和发展的重要因素。已经提出肝细胞衍生的和单核细胞衍生的外泌体均调节巨噬细胞表型，导致ALD的炎症反应。暴露于乙醇的单核细胞释放大量的外泌体，刺激原始单核细胞极化并分化成 M2巨噬细胞。暴露于酒精的单核细胞也分泌含有增加的 miR-27a 水平的外泌体，促进细胞因子分泌增加，导致其他单核细胞的激活和极化[42-43]。通过外泌体携带的CD40配体在ALD的实验模型中促进巨噬细胞活化[44]。这些发现表明，疾病状态下细胞分泌的外泌体水平增加，并引发各种病理事件。NAFLD特征是由脂质和巨噬细胞相关炎症诱导的肝细胞功能障碍和死亡导致。源自肝细胞的脂质诱导的外泌体含有肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体，并在小鼠骨髓来源的巨噬细胞中诱导炎症表型[37]。受损的肝细胞还释放富含神经酰胺的外泌体，其具有激活巨噬细胞趋化性，这是在脂毒性条件下向肝脏募集巨噬细胞的潜在机制[45]。NAFLD患者分泌的巨噬细胞和自然杀伤性 T 细胞来源的外泌体水平增加[46]。外泌体参与先天性免疫反应伴脂肪变性，表明它们在从早期 NAFLD 进展到 NASH 的过程中发挥作用，可能刺激炎症细胞，导致组织损伤的恶化。

3.5 肝衰竭肝衰竭是指肝脏的合成和代谢功能发生严重障碍，临床上表现为黄疸、腹水、肝性脑病和凝血功能障碍，可导致多器官功能衰竭和死亡。目前，最终的治疗选择是原位肝移植，但受到器官短缺、高费用和终身免疫抑制药物需求的限制，迫切需要新的有效治疗方法。陈露[47]的实验结果显示，MSCs来源的外泌体注射到急性肝衰竭小鼠模型体内后，可显著抑制小鼠血清中ALT和AST的升高，抑制炎症因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的升高，并抑制肝脏细胞的调亡。有报道称，MSCs来源的外泌体可以通过 mRNA 和 miRNA 的水平转移及将抗原呈递给靶蛋白来减轻组织损伤[48]。Chen等[49]观察到女性月经血来源的外泌体在急性肝功能衰竭中具有抗细胞凋亡能力。外泌体的黏附分子和 mRNA通过水平转移来自人肝干细胞的mRNA 亚群，促进肝切除模型中残留肝细胞再生[50]。MSCs衍生的外泌体可以抑制炎症因子的风暴，抑制细胞凋亡，促进血管生成，提供能量支持，促进肝细胞增殖，并通过分子转移和膜结合促进胆汁恢复以逆转肝衰竭[51]。

4 外泌体作为肝脏疾病诊断和预后的生物标志物

临床上患者管理决策取决于对肝病严重程度和进展的准确评估，肝脏活检是“黄金标准”，但具有侵入性、昂贵且风险大的特点。外泌体的组分是患者潜在病理状态的动态“指纹”，能够越过血-脑屏障，稳定地在循环血浆和血清检测到，分析血液或尿液中的生物标志物所需的流体活组织检查是微创的，这可能成为鉴定和评估与肝病相关分子特征的新生物标志物。Estrabaud等[52]表示，血清 miR-122 水平与所有基因型的 HCV 水平变化、治疗反应、治疗结果密切相关，因此，miR-122 被提出作为肝损伤新的生物标志物。miR-199a 的低表达与 HCC 的恶性潜能及预后不良显著相关，在Murakami等[53]研究中，持续免疫应答组血清中 miR-199a 水平显著高于持续病毒应答组，血清 miR-199a 在肝硬化和 HCC 患者中显著下降，表明 miR-199a 可用作 HCC 的潜在生物标志物[54]。miR-21可在肝癌和CHB患者的血清中检测到。与 CHB 组和健康个体相比，肝癌患者血清外泌体中 miR-21 表达水平显著增加，并与肝硬化和肝癌分期相关。更重要的是，外泌体 miR-21 的浓度显著高于全血清，这表明外泌体 miR-21将是更敏感的诊断标志物[55]。在 HCC 患者的血清中，发现 miR-18a、miR221、miR-222 和 miR-224 的外泌体含量均显著高于肝炎组和肝硬化组，而miR-101、miR-106b、miR-122 和 miR-195表达水平显著降低[56]。HBV和HCV早期诱导的肝纤维化患者的外泌体中发现miRNA 的表达增强，表明这些外泌体相关 miRNA可能用作肝纤维化早期阶段的标志物[57]。总之，这些信息说明可将外泌体作为肝病的潜在诊断生物标志物，但需要进一步开展工作。

5 外泌体可作为肝脏疾病治疗新手段

对外泌体含量、生物发生和释放机制的研究不仅可以提高我们对某些疾病的认识，还可以使研究人员更好地针对它们进行治疗。外泌体因其天然物质运输性质，长期固有的循环能力和优异的生物相容性而具有作为药物递送载体的巨大潜力，适合于递送多种化学品、蛋白质、核酸和基因治疗剂，以提高靶向准确性，降低最小剂量和不良反应，为诊断和治疗创新提供机会。Tan等[58]发现，外泌体可以在体外促进 Bcl-xL 蛋白表达来抑制乙酰氨基酚和H2O2诱导的肝细胞凋亡。Li等[59]实验显示，MSC衍生的外泌体通过抑制上皮间充质转变并再将它们直接注射到小鼠纤维化肝脏中保护肝细胞来减轻CCl4诱导的肝纤维化，并且人类MSCs衍生的外泌体在体外对人肝细胞系HL7702显示出相似的有益作用。Yan等[60]报道，在人类MSC衍生的外泌体中包含谷胱甘肽过氧化物酶1，在肝脏氧化损伤的恢复中起着至关重要的作用，并且Zhang等[61]发现，其具有类似于MSCs的免疫抑制能力，可以诱导 Treg 细胞和抗炎细胞因子并改善激活的免疫系统。当与外周血单核细胞共培养时，MSCs衍生的外泌体促进调节性 T 细胞群的增殖并抑制T细胞增殖[62]。在外泌体中发现了IL-1β、IL-6、转化生长因子β和血管内皮生长因子等可以调节免疫细胞[63]。人羊膜上皮细胞衍生的外泌体显著减少肝纤维化过程中巨噬细胞的数量。从血清中分离的外泌体也已显示在具有肝纤维化的小鼠中有治疗效果，来源于健康小鼠血清的外泌体减少CCl4损伤或硫代乙酸损伤的小鼠肝纤维化，小鼠表现出肝功能改善，肝细胞凋亡减少，受损肝脏炎症反应抑制，肝脏促炎性细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF-γ 和 TNF-α)释放减少，炎症浸润减少，AST/ALT血清水平降低[35]。上述研究结果表明，外泌体可以抑制肝细胞凋亡，逆转肝纤维化，支持肝细胞功能，促进血管生成，促进肝细胞增殖再生，减少炎症性损伤。

6 结语

外泌体携带多种分子如 DNA、蛋白质、miRNA、mRNA、lncRNA，在肝内进行细胞-细胞间联络，与肝脏的病理生理学密切相关，被视为预测性生物标志物，在肝病诊断、治疗及预后中起重要作用，是潜在的治疗靶标。病毒性肝炎在肝细胞之间的传播是通过从感染细胞中释放含病毒的外泌体来介导的；肿瘤细胞分泌的外泌体可促进肿瘤生长和抗肿瘤免疫反应。在NAFLD或ALD期间从肝细胞获得的外泌体驱动巨噬细胞中的活化或趋化性，以及分别在内皮细胞或HSCs中的血管生成和活化；来自健康人体的外泌体可以引发纤维化消退，来自病理状态的外泌体促进肝纤维化的发展；在肝衰竭中，MSCs来源的外泌体可以逆转肝衰竭，促进肝再生。虽然近年来学者们对外泌体的组成、释放、摄取及功能的理解有所进展，但目前仍有几个突出的挑战和问题有待进一步解决：一是大量制备、分离、纯化及保存外泌体的方法尚未成熟；二是治疗外泌体的正确来源尚不明确；三是关于外泌体在肝脏中生物发生、释放、靶向和与靶细胞相互作用的精确分子机制知之甚少。因此，目前需进一步研究解决这些问题更好地利用他们为临床服务。