黄 秀 徐建国 聂振朋 王 平 孙立方 孙建华 柯甫志
(浙江省柑橘研究所/国家柑橘品种改良中心浙江分中心 台州 318026)
柑橘黄龙病是柑橘产业中最具毁灭性的病害之一,严重影响柑橘产业的健康发展[1,2]。因全球气温变暖造成的木虱繁殖和活动范围加大以及柑橘嫁接、苗木的频繁调运,致使黄龙病在亚洲、美洲、非洲等柑橘主产区泛滥成灾[1,3]。如巴西圣保罗州南部橘区,黄龙病的发病率达到30%以上[5],而美国佛罗里达州,自2005年首次发现黄龙病以来,种植面积和产量分别下降了38%和74%[3],我国自20世纪首次在华南地区发现黄龙病以来,已有超过半数以上柑橘主产区受到为害,为害面积逐年增加,对我国的柑橘产业造成巨大经济损失[6, 7]。
目前,世界范围内对黄龙病的防治都没有十分有效的手段。生产上多采用对媒介昆虫木虱的防治检测、砍除病株以及无病毒苗木的培育等手段预防黄龙病的发生和传播[8,9],其中无病毒苗木的培育也是控制黄龙病蔓延的重要前提。采用高效、简便的脱毒技术获得无病毒优质苗木用于提高柑橘产量和品质,对柑橘产业的健康发展至关重要。
本文对柑橘黄龙病以及柑橘主要脱毒技术的原理和研究进展进行阐述,为柑橘无病毒优良品种苗木的推广和规模化发展提供理论基础和技术参考。
柑橘黄龙病(Citrus huanglongbing pathogen,HLB)又称青果病,由尚不能培养的韧皮杆菌属中的一种革兰氏阴性细菌引起的病害,根据病原体的不同主要分为三类,即亚洲种(Ca.Li.asiaticus),非洲种(Ca.Li.africanus)和美洲种(Ca.Li.americanus)[10],目前在我国流行最广、为害最严重的主要是亚洲种。亚洲种黄龙病菌在柑橘品种中流行趋势随季节改变而不同,在春季温度和湿度利于黄龙病菌繁殖的环境下,症状明显,传染加剧;在温度达到35℃以上的夏季,症状有一定程度的减弱。黄龙病菌主要寄生在根系、叶片等器官韧皮部组织的筛管细胞中,主要通过维管束和孢间连丝在树体内传播,在柑橘品种间通过接穗嫁接,木虱、赤眼蜂等传播媒介等进行传播。
柑橘树体感染黄龙病后,筛管组织和韧皮部导管被堵塞甚至坏死,基因表达改变,淀粉合成增加并在叶片中积累破坏叶绿体结构和堵塞运输系统,干扰营养合成以及转运阻碍植物生长[11],树体严重衰弱,根系腐烂受损,出现叶片变小、斑驳或缺素症黄化、小枝枯死、果实变小、畸形、有苦味等症状,落果现象严重,致使柑橘品质降低、产量下降[12,13]。
在感染黄龙病的早期阶段,染病树体往往有几个月到几年不等的无症状期,此时在田间用肉眼无法将其与健康树木区分开,再者,染病树体早期症状如嫩梢变黄,与缺锌症相似,果农容易对其做出不正确的诊断,以致染病树体不能及时得到清除,成为无法预防的传播源。现在所有的商业柑橘品种均不抗黄龙病,存在被感染的风险[2,10]。而经脱毒后的柑橘苗木因本身不带病毒,也无其他病虫害的危害,苗木根系发达生长健壮,比普通苗木生长速度快、盛产期早、产量高、果实大且品质高、整齐度好等,受到广大橘农推崇。因此,无病毒苗木的培育不仅是防治黄龙病的重要手段,也是提高柑橘产量和品质,促进柑橘产业发展的重要基础和前提。
目前柑橘脱毒技术主要有:茎尖嫁接,热处理、化学药剂处理以及近些年新出现的玻璃化法-超低温脱毒技术等。
柑橘茎尖嫁接技术已被证实可以脱除柑橘黄龙病等多种病害[14],也是目前生产上用于获得柑橘无病毒苗木比较常用的技术。主要依据病毒在植物体内分布不均匀性原理,将顶端分生组织不带毒区域切下并嫁接到健康砧木上进行培育获得无病毒植株。
自采用柑橘茎尖嫁接技术并用此法得到少量嫁接植株至今,已有很多人采用此法得到多种柑橘品种的无病毒植株,如Navarro等用此法成功培育出不含病毒的柑橘母本树,并在生产上推广种植无病毒苗,提高了柑橘品质和产量[15]。后又有研究人员对此法进行改进和优化,提高了嫁接成活率[16-18]。如José等[14]对柑橘茎尖嫁接脱毒技术进行优化,使病毒清除率提高到95%,茎尖成活率也达到50%以上[14]。陈毅群等[18]以 3个脐橙品种为试材进行茎尖嫁接脱毒条件优化,结果表明,以诱导离体枝条产生的不定芽进行茎尖嫁接的嫁接苗萌发率显著提高,同时也解决了因季节原因造成的少芽和无芽问题。
采用茎尖嫁接法培育出的无病毒植株具有结果树龄显著缩短、无不良变异等特点,但茎尖嫁接法对试验条件以及操作人员的技术水平要求极高,操作困难,嫁接过程始终有病毒清除率与茎尖存活率不能兼得的问题存在。
热处理脱毒利用病原体和寄主细胞对温度耐受性不同的原理[2,17],适当温度的加热使植物组织中的病原菌钝化或死亡,使植物组织细胞不含病毒或无病毒区域增大,再对无病毒的植物组织进行后续培养成为安全的种质或繁殖材料。
研究表明,对感染黄龙病的树体或接穗进行热处理,能降低树体或接穗中黄龙病菌含量并能在一定时间里保持无病状态。如郭俊等[19]为清除尤力克柠檬接穗中的黄龙病菌进行不同温度、不同时间的热水浸泡处理,结果表明热水处理能有效清除黄龙病菌、接穗无褐化且嫁接发芽率高达93.0%。Hoffman等[17]在温室中对感染黄龙病菌的柑橘幼苗进行40~42℃连续热处理至少48h后,经检测热处理能显著降低或完全消除柑橘幼苗中黄龙病菌;之后对感染黄龙病的葡萄柚、甜橙、柠檬以及柚子的休眠芽进行为期 4个月的热处理,得到24个经热处理的休眠芽中只有3个在12月后呈现黄龙病阳性,而21个未进行热处理的休眠芽有11个表现阳性,而且热处理对休眠芽的萌发没有明显影响。
虽然热处理对黄龙病菌有一定的抑制作用,但柑橘黄龙病的热处理脱毒与热处理时间、温度以及柑橘品种有关[17],苗木或接穗经热处理后可能出现干枯、不出芽、死亡等情况,甚至有些树在两至三年后又重新出现病状[17,19],而且整株苗木进行热处理,耗费大,操作繁琐。目前,热处理常作为一种预处理方式与茎尖嫁接结合脱除柑橘病毒。
化学药剂脱毒主要利用植物病菌对一些抗菌素的敏感性,抗菌素使病菌钝化或死亡,从而抑制树体病菌的繁殖和扩散,达到脱毒效果。
关于化学药剂处理清除柑橘黄龙病菌的研究已经取得不小进步。祁鹏志[20]对10个柑橘品种的茎尖用20 mg/L病毒唑处理10 min,后经嫁接培养得到茎尖嫁接苗,经PCR检测,结果均不含黄龙病菌。近年来,科研人员又对抑制柑橘黄龙病菌的候选药剂展开筛选研究,并得到很多能不同程度抑制黄龙病菌繁殖的药剂[21]。如Zhang等[22]采用嫁接法从五种化合物中快速筛选有效抑制黄龙病的潜在药物,得到青霉素和链霉素混合物最能有效清除接穗中的黄龙病菌。之后Zhang等[21]又采用同样方法从31种抗生素类抗菌剂中系统筛选对抑制黄龙病菌有效的药物,得到氨苄西林、卡比西林、青霉素、头孢氨苄、利福平、磺胺二甲氧嘧啶等多种抗生素均能有效地消除或抑制接穗中的黄龙病菌。
四环素、链霉素等抗生素类药物虽能使黄龙病菌钝化或部分死亡,但不能将其彻底根除,而且频繁使用不仅增加生产成本,还可能导致抗药菌的产生,对人类健康也存在潜在副作用[21,23]。随着抗生素对公众健康构成的巨大挑战,人们着手在非抗生素药物以及离子或纳米颗粒中展开研究。Yang等[24]采用优化的嫁接技术从39种非抗生素抗菌药物中,系统筛选得到8种(氢氧化铝、D,L-丁硫氨酸亚砜胺、尼古丁、枯草芽孢杆菌表面活性剂、银达因、胶体银、EBI-601和EBI-602)有效消除或抑制黄龙病菌的非抗生素类抗菌剂,并被批准应用于农业生产。Jose等[25]对银纳米粒子杀灭黄龙病菌的能力进行测试,结果得银纳米粒子能降低树体内黄龙病菌的浓度且杀菌能力显著高于β-内酰胺类抗生素。这些非抗生素类抗菌剂、新型银纳米粒子等可作为清除黄龙病菌获得无病毒苗的潜在候选药物。
玻璃化法-超低温脱毒是建立在玻璃化法-超低温保存基础上的一种新型脱毒技术,依据病毒在植物体内分布不均匀的原理,在液氮提供的-196℃超低温环境下对含有病毒的分化细胞进行破坏,而不含病毒或病毒含量少的顶端分生组织在一定条件下恢复生长,达到脱去植物病毒的目的[26]。
研究表明,柑橘茎尖经玻璃化法-超低温技术保存后可再生成完整植株[27,28]。Ding等[29]采用玻璃化法-超低温保存技术从 5种不同品种的柑橘试管苗中成功清除黄龙病病菌,经后续培养得到健康植株,该方法的茎尖存活率达到76%以上,病毒清除率高达98.1%,而且该技术对茎尖大小要求不严格,茎尖大小在 1.5mm左右即可,降低了对操作技术的要求。曹庆等[30]研究表明,即使采用2.0~2.5 mm大小的柑橘茎尖,病毒清除率也能达到88.2%及以上。作为一种新型脱毒技术,玻璃化法-超低温处理在柑橘脱毒方面具有很好的应用前景。
此外,化学处理协同热处理与茎尖嫁接技术结合,可获得较好的脱毒效果。如陈传红等[31]在茎尖嫁接培育柑橘脱毒苗时,采用40℃高温对 0.6 mm的茎尖进行处理,后经茎尖嫁接获得的嫁接苗脱毒率高达93.21%,成活率亦达到63.32%,提高了茎尖嫁接脱毒效率。Yang等[32]用磺胺类抗生素清除柑橘黄龙病的同时进行45℃热处理,表明45℃高温处理可以增强柑橘的活力,促进根的生长,与单独热处理或抗生素处理相比,45℃高温处理结合抗生素处理显著降低幼苗中黄龙病菌含量,也说明协同作用比单独的热处理或药剂处理效果更好。热处理和化学药剂与茎尖嫁接技术结合可提高脱毒成功率,主要是温度、化学药剂对感病接穗的预处理抑制了病毒繁殖和扩散,热处理同时也提高了树体对化学药剂的吸收和利用效率,使长出的嫩芽茎尖生长点无毒区域相应变大,一定程度上降低茎尖嫁接过程对技术的要求,提高了病毒清除率和茎尖成活率。
除以上脱毒方法,还有珠心苗培育、愈伤组织等,通过培育珠心组织获得无病毒苗木是柑橘脱毒最早使用的一种方法。但经珠心组织培育出的植株易发生变异成为变异品种,缺乏实际生产价值。再者,对于像红美人、由良等优良无核柑橘品种,因花粉完全败育,没有种子形成,通过实生播种获得珠心苗比较困难,因此生产上较少采用此法进行无病毒苗的培养。
柑橘产业受黄龙病的影响,对其防治刻不容缓,而栽种无病毒苗木是预防黄龙病传播的必要手段之一,因此需要迫切地建立一套高效、简便、周期短的柑橘无病毒苗繁育体系。
在培育脱毒苗方面,科研人员付出很多努力,得到一些较好的培育方法。但也存在一定问题:(1)茎尖嫁接法脱除黄龙病菌对操作人员的技术水平要求极高,嫁接过程始终存在病毒清除率与茎尖存活率不能兼得的问题;(2)虽然如今研究得到的化学药剂一定程度上使黄龙病菌钝化,但不能将其彻底根除,仍没有找到一种彻底杀死黄龙病菌的特效药;(3)柑橘玻璃化法-超低温脱毒技术具有高效、简便、脱毒效率高等优点,但仍没有建立起一套完整适用于生产的柑橘玻璃化法-超低温脱毒技术体系,需要加强该方面研究;(4)现在脱毒苗的生产周期较长,一般条件下一个品种的脱毒至少需要两年;(5)不仅要加强无病毒苗木培育的研究,还要加大生物技术在柑橘抗病品种培育中的应用,如利用基因编辑CRISPR/Cas 9、转基因等技术,培育对黄龙病抗病品种,全面推动柑橘产业的健康发展。