相分离影响癌症发生发展的研究进展

顾 湘，贾世翀，葛盛芳，范先群

细胞是生物体基本的结构和功能单位，参与生物体复杂的生命活动。在真核生物中，细胞内形成了不同的区室，以确保不同的生化反应在各自区室内独立、高效且有序地进行。细胞器利用其磷脂双分子膜在细胞内形成相对独立的亚细胞结构，发挥特定的功能。此外，细胞内存在许多无膜区室，如细胞质中的压力颗粒(Stress Granules，SG)，细胞核中的核仁、斑点、Cajal小体等。这些无膜区室，也被称为“生物分子凝聚体”。研究表明，生物分子凝聚体的组装通过“液-液相分离”(Liquid-Liquid Phase Separation，LLPS)，通常简称为相分离实现[1]。

1 相分离的概念

相分离指在相对均匀的介质中，细胞内的分子因理化性质的差异自发地聚集或分离，形成相对独立的无膜区室[2]。相分离是依赖于多价相互作用的动态过程，生物凝聚体中的分子因其之间的多价相互作用与外部溶液中的分子解离，在局部形成超过浓度阈值的高度浓缩的“相”，促使生物分子凝聚体中的分子重新排列，并与外部溶液中的分子发生交换。生物大分子之间的多价相互作用可通过蛋白质的多位点修饰，蛋白质的固有无序区域(Intrinsically Disordered Regions，IDRs)，RNA的核苷酸重复扩展等来实现[3]。

2 相分离的研究历史

自从19世纪30年代在神经元细胞核内观察到第一个无膜区室——核仁以来[4]，研究者们发现几乎所有真核细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上都存在类似的结构，并对其成分、位置和功能有了一定的认识，但是对其形成原因和物理性质长期以来知之甚少。一些早期的研究认为，这些生物分子凝聚体是不稳定的。2005年，有研究将Cajal小体描述为“漂浮于半流质核质中的半流质球体”[5]，但一直缺乏证据证明其明确的物理性质。2009年，Brangwynne等人[6]在显微镜下观察秀丽隐杆线虫的P颗粒形成过程时发现P颗粒并非固体颗粒，而是以“液滴”形式存在，且具备以下特点：①在游离状态下呈球形(表面张力作用下)，附于细胞核表面时为非球形，类似于液体在固体表面的湿润状态；②剪切力作用下可在其他结构表现为变形、流动、裂变；③相互碰撞后融合并松弛成球形；④光漂白恢复实验表明其内部分子可流动并与外部溶液中的分子快速交换。他们推测在细胞中存在一种方式，使细胞内的特定分子聚集，维持细胞内部结构处于一定的“秩序”中。随后，核仁和其他生物分子凝聚体中也发现存在类似的“液滴”现象[7]。2012年，Kato等[8]分别在体外重构出了与体内生物分子凝聚体类似的蛋白质和RNA液滴，揭示了生物分子凝聚体是一种相分离现象，且可以通过体外重构相分离模拟体内生物分子凝聚体的性质和功能。

3 相分离的生理功能

相分离参与调控细胞代谢。在核苷酸代谢中，胞苷三磷酸(Cytidine Triphosphate，CTP)合成酶是嘧啶合成的关键酶，催化尿苷三磷酸(Uridine Triphosphate，UTP)和谷氨酰胺转化为CTP和谷氨酸。在冷冻电镜下观察到，人的CTP合成酶通过相分离形成凝聚体。并且，增加底物UTP和腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)可促进其凝聚，而增加产物CTP和腺苷二磷酸(Adenosine Diphosphate，ADP)则抑制其凝聚[9]。以上研究提示代谢酶的相分离有利于促进其酶活性。此外，在脂肪酸代谢中，乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase，ACC)催化乙酰辅酶A的羧化反应参与脂肪酸合成[10]。当机体处于饥饿状态时，ACC会和柠檬酸盐结合形成ACC-柠檬酸盐二聚体并组装成具有更高酶活性的凝聚体，促进脂肪酸的合成。然而，当脂肪酸合成产物过多时，凝聚体内的二聚体则被局限于非活性构象中，抑制其酶的活性[11]。以上研究表示，在不同的环境中，相分离可通过调节酶的凝聚，激活或抑制酶的活性，从而调控细胞代谢。

相分离参与调节信号转导。LAT-Grb2-SOS可通过相分离在膜表面形成凝聚体，延长SOS在膜上的停留时间，从而增强SOS对Ras的激活作用，调控T细胞活化[12]。突触后致密区(Postsynaptic Density，PSD)是紧贴于突触后膜的蛋白质密集区，它使受体靠近神经递质释放区域，确保突触间信号的传递。Zeng等[13]通过体外重建证明了4个主要的PSD支架蛋白，PSD-95、GKAP、Shank和Homer可以在生理浓度通过相分离形成凝聚体，并且这些凝聚体可以促进肌动蛋白聚集及阻止抑制性突触后蛋白的进入，由此推测相分离参与调控突触信号传导。

相分离参与调控基因表达。异染色质通过异染色质蛋白1(Heterochromatin Protein 1，HP1)压缩染色质和聚集配体，从而介导基因沉默。研究发现，HP1通过相分离形成凝聚体，将包装紧密的染色体封闭在凝聚体中，阻止其表达，从而使目的基因沉默[14]。此外，通过相分离形成的细胞内无膜区室核糖核蛋白(Ribonucleoprotein，RNP)可以通过调控mRNA的定位控制蛋白质翻译的产量[15]。

相分离参与调控蛋白质稳态。细胞核中的胁迫敏感蛋白在胁迫条件下发生错误折叠，由核质弥散状态聚集至核仁中，与核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin1，NPM1)通过相分离结合，降低移动速度从而避免错误折叠蛋白的不可逆聚集。同时，分子伴侣Hsp70进入核仁与NPM1结合，修复错误折叠蛋白，使其在胁迫条件消失后重新回到核质发挥功能。然而，当胁迫时间过长或分子存在致病结构时，核仁将无法帮助错误折叠蛋白恢复功能[16]。以上研究提示核仁可以通过相分离，修复折叠紊乱蛋白，成为相分离蛋白质控中心。

4 相分离与癌症

相分离参与调控细胞代谢、信号转导、基因表达和蛋白质稳态等多种生物体生理功能，对于维持机体内稳态意义重大。最近，相分离与癌症之间的关系引起了广泛关注。基因组不稳定性导致的细胞异常增殖分化是癌症的重要发病机制。相分离参与了机体维持基因组稳定的多个过程，参与了与癌基因和抑癌基因相关的多种调控，因此，相分离与基因组不稳定性所导致的癌症密切相关。

4.1 相分离影响DNA修复过程 在人体的细胞中，代谢活动和环境因素(如紫外线和放射线)造成不计其数的DNA损伤，DNA修复是人体防止基因组损伤和突变的必要过程。相分离参与DNA修复蛋白的凝聚过程，相分离异常导致DNA修复蛋白凝聚体的缺乏会干扰DNA修复，导致受损DNA的不断堆积和基因组不稳定，从而驱动癌症的发生和发展。如DNA修复蛋白Rad52通过相分离在体内或体外凝聚，这个过程依赖于Rad52蛋白的长IDRs。当使用1,6-己二醇或通过截短其IDRs破坏Rad52的相分离时，DNA损伤的敏感性提高，提示Rad52的相分离在DNA修复中有重要意义[17]。此外，p53结合蛋白1(p53-Binding Protein 1,53BP1)凝聚体促进非同源末端连接，在DNA修复中起重要作用。研究表明，在小鼠体内，如发生相分离异常导致53BP1凝聚体缺乏，会导致基因不稳定和辐射敏感性增加，并且与肿瘤的快速进展和预后不良有关[18]。DNA损伤时，DNA修复酶PARP1定位于损伤部位并发生自发的聚ADP核糖基化，触发FET蛋白家族(包括FUS、EWS、TAF蛋白)相分离，聚集损伤的DNA，促使其连接修复，增加DNA修复效率。

4.2 相分离影响转录调控 在癌症中，DNA转录调控往往受到干扰，从而加速了癌症的进程。超级增强子是增强子集合体，比单个增强子具有更高水平的调控基因转录的能力。由于超级增强子能调控癌症中的关键致癌基因，使其达到更高水平的转录量，在加速癌症进程中起着关键作用。最近的研究表明，含有IDRs的转录因子，转录共激活因子和RNA聚合酶Ⅱ在超级增强子的靶基因处相分离形成生物分子凝聚体从而激活这些转录调控元件的表达，揭示了超级增强子通过相分离聚集转录调控元件[19]。

EWS和FUS蛋白能导致儿童结缔组织癌的发生，包括黏液样脂肪肉瘤和尤文肉瘤。在这些癌症中，EWS和FUS蛋白N-末端的IDRs介导相分离并和转录因子的DNA结合域(如FLI1和CHOP)连接。研究表明，连接形成的融合蛋白FUS-CHOP和EWS-FLI1可以促进其转录活性[20]。

4.3 相分离影响癌基因和抑癌基因的表达 E3泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白(Speckle-typePOZ Protein，SPOP)调节多种肿瘤相关蛋白的降解，如肿瘤抑制因子PTEN、ERK磷酸酶、Hedgehog途径转录因子Gli2等。SPOP是E3泛素连接酶底物的配体，定位于核斑点处。其突变引起蛋白调节途径的失调可导致前列腺癌、子宫内膜癌等多种实体肿瘤[21]。此外，SPOP的底物死亡结构域相关蛋白(Death Domain-associated Protein，DAXX)定位于早幼粒细胞(Promyelocytic leukemia，PML)小体，参与调节转录，细胞信号转导和凋亡等。DAXX可以通过下调肿瘤抑制因子的转录活性，如ETS1、p53和抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进肿瘤生长[22]。尽管SPOP和DAXX分别定位于两种生物分子凝聚体核斑点和PML小体中，它们共表达时会形成新的生物分子凝聚体SPOP/DAXX小体。癌症相关的SPOP突变会干扰相分离形成SPOP/DAXX小体，导致PML小体中的DAXX活性增长，进而加速肿瘤生长[23]。

此外，结构不稳定的抑癌因子p53会发生错义突变，与其同源物p63和p73形成生物分子凝聚体，导致其抑癌功能丧失，促进癌症的发生。在高级别浆液性卵巢癌的动物模型中已证实，抑制p53凝聚体的形成，可恢复其调节靶基因抑制细胞增殖和促进细胞死亡的能力[24]。

4.4 相分离影响PML小体的形成 PML小体是通过相分离组装的生物分子凝聚体，参与了DNA损伤反应、转录、细胞周期调控、凋亡等多种生理过程。同时，PML小体也与多种癌症相关。在急性早幼粒细胞白血病中，染色体易位导致PML蛋白N-末端和维甲酸受体α(Retinoic Acid Receptor-alpha，RARα)结合，形成PML-RARα，破坏了PML小体，形成了分散的微斑点。PML微斑点缺乏转录共激活因子，延迟DNA修复蛋白的凝聚和ATM的激活，导致基因不稳定，从而促进癌症的进展[25]。

4.5 相分离影响端粒维持机制 在真核生物细胞复制过程中，端粒会不断地缩短，导致端粒介导的细胞衰老和凋亡。在肿瘤发生过程中，肿瘤细胞会通过端粒维持机制避免端粒缩短实现持续复制。大多数肿瘤通过激活端粒酶的方式维持端粒，而有一部分肿瘤，如肉瘤，内分泌肿瘤，胶质母细胞瘤等则通过同源重组维持端粒，这一过程称为替代端粒延长机制(Alternative Lengthening of Telomeres，ALT)[26]。ALT相关PML小体(ALT-associated PML Bodies，APBs)是触发ALT的关键机制之一。端粒DNA的损伤诱导端粒蛋白发生SUMO化修饰，促使端粒在PML小体中聚集，通过相分离形成生物分子凝聚体APBs。APBs通过BLM和Rad52介导的DNA合成过程触发ALT[27]。

4.6 相分离影响SG的形成 生物分子凝聚体SG也与癌症有关。SG蛋白YB1参与调控基因转录和翻译，通过调控SG蛋白G3BP1促进SG的组装。研究表明，在肿瘤中YB1过表达与肿瘤耐药性和不良预后有关[28]。并且在小鼠肿瘤种植模型中发现，敲除YB1或G3BP1可通过减少SG的组装抑制肿瘤的侵袭和转移[29]。由此推测，YB1通过促进SG的组装加速肿瘤进展。

此外，KRAS基因介导Ras/MAPK信号通路控制细胞的增殖分化，其突变会导致许多组织细胞发生恶变。研究发现，KRAS突变的肿瘤细胞中，SG组装明显增加；若抑制突变细胞中的SG组装，细胞会对外界的压力更敏感，提示SG组装可增加肿瘤对压力的适应性[30]。

5 总结与展望

多价相互作用介导的相分离驱动人体内多种生物分子凝聚体的组装，参与调控细胞代谢、信号转导、基因表达和蛋白质稳态等生理过程，帮助维持机体内环境的稳定。因此，相分离异常破坏机体内稳态时，会导致疾病的发生。癌症是与相分离密切相关的疾病之一，除了相分离异常导致的基因组不稳定能促使癌症的发展以外，部分相分离驱动形成的生物分子凝聚体本身在癌症的发生发展中也占有一席之地。相分离与癌症之间关系的研究，目前主要停留于其组装形成的生物分子凝聚体在癌症中的作用，而缺乏相分离的动态过程在癌症中的内在机制研究。因此，相分离与癌症的关系仍需进一步的探索。尽管目前可以通过体外重构相分离模拟体内生物分子凝聚体的性质和功能，但是一方面由于生物分子凝聚体的液体特性和动态过程，现有的光学显微技术难以深入观测相分离的精细结构；另一方面体内的环境和分子调控机制十分复杂，体外模拟条件无法完全替代。因此，需要发展新的技术和不断优化体外相分离条件，进一步挖掘相分离的具体过程、精细结构、动态调控、起始和终止信号。此外，在相分离与癌症的关系方面，与癌症表型相关的相分离分子机制仍需深入探索。未来的研究方向可聚焦于相分离的理化功能，如选择性富集分子，增加分子间相互作用概率和改变分子构象在癌症发生发展中的作用，以及寻找调节相分离的关键分子，如激酶和分子伴侣，以便深入挖掘癌症的致病机制和调控方式，寻找癌症治疗的新靶点。