多发性硬化代谢组学研究进展

王蒂媛 殷旭华 米飞跃

1）内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010058 2）内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特 010059

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）被认为是中枢神经系统自身免疫介导的炎性脱髓鞘疾病，以血脑屏障破坏、轴索损伤、胶质增生、脱髓鞘为主要特征［1-2］，该病的临床特点为时间多发性和空间多发性，可表现为反复发作的视力下降、复视、肢体感觉障碍、肢体运动障碍、共济失调、膀胱或直肠功能障碍等。该病呈全球性分布［3］，各地发病率不同，预计全球有250万患者，MS的发病年龄20～40岁，女性多见，是年轻患者非创伤性残疾的首要原因，给家庭及社会带来极大的经济负担［4］。

早期防治可以延缓疾病的进展，改善患者的生活质量。研究表明环境和遗传因素会增加MS的风险［5］，但疾病的确切因素尚不清楚，使得疾病的准确诊断、预后和治疗变得复杂。对MS的深入研究有助于进一步理解其病理生理特点，了解发病机制以及进一步寻找其潜在的诊断或治疗靶点。代谢组学是一种高通量、高灵敏度的检测技术，主要针对细胞、组织、体液中相对分子量＜1 000的小分子进行分析，是连接各种生物过程的代谢途径的分支［6］。代谢组学从疾病下游小分子层面认识疾病的内在过程，能够更直接、更准确地反映生物体的生理状态，是转录组学和蛋白质组学的延伸，提供无法从基因组学、转录组学或蛋白质组学等其他技术获得的信息，且其可作为一种精确的非侵入性工具辨别药物治疗的作用机制，区分遗传学、微生物组活性和营养对整体代谢表型的贡献，正越来越多地被用于开发疾病的生物标记物和确定致病机制等［7-9］。因此，运用代谢组学可能会为理解MS的复杂性和发病机制提供另一个见解，且有潜力成为多发性硬化诊断和治疗的工具。近年来，越来越多的学者将代谢组学技术运用于MS的研究。本文总结了近年来国内外相关文献，从发病机制、诊断、监测疾病进展、分期、鉴别其他相关疾病以及预测药物疗效等方面进行综述。

1 代谢组学技术概述

代谢组学诞生于20世纪末，由英国伦敦帝国大学NICHOLSON教授提出［10］。目前代谢组学分析最流行的3个平台是磁共振技术（NMR）［11］、气相色谱-质谱法（GC-MS）［12］和液相色谱-质谱法（LC-MS）［13］。这些技术均可以高通量、自动化的方式检测、识别和量化代谢物。磁共振在代谢物鉴定和自动化方面具有优势，但灵敏度较低，检测范围局限，仪器成本稍高等缺点限制了其广泛使用。GC-MS具有灵敏度高、仪器成本低等优点，但样品前处理工作量较大。与前两种比较，LC-MS应用范围相对广泛，可对大部分小分子代谢物进行准确、灵敏的鉴定。

非靶向和靶向性分析是代谢组学研究的两种主要方法［14］。非靶向方法用于生成假设，能够对生物样品中的所有代谢物进行检测，可以更广泛地了解整个代谢组和相关表型，通常被认为是基于假设生成发现的模型。相反，靶向方法是通过对先前假设的测试驱动的，该假设能够对最多20种特定但有限的代谢物进行绝对量化。两种方法的联合使用可以实现精确识别和完整量化。

2 代谢组学在MS中的研究

2.1诊断方面目前MS的诊断以2017年修订的McDonald标准作为金标准［15］，强调时间和空间上的多发，但在临床上MS常因首次发作的时间多发性和空间多发性证据不足，且诊断缺少特异性标志物，因而容易误诊和漏诊。为了提高早期诊断率，人们开始思考是否存在其他的生物标志物可以提高MS的诊断。随着代谢组学技术的发展，其逐渐应用于MS。早在1993年，LYNCH等［16］用磁共振检测到MS患者和正常对照组脑脊液中存在差异代谢物。后又有人利用质子磁共振谱进行代谢谱分析，结果显示与对照组相比，MS组硒含量明显降低［17］，但当时所鉴定出来的差异代谢物数量较少。PODDIGHE等［18］采用质谱技术对16例MS患者和12名健康对照者的血浆进行代谢组学分析，发现2组天冬酰胺、鸟氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸等代谢物存在差异，这些发现与使用磁共振方法分析脑脊液样本的研究结果相似［19］。在一项最近的研究中，使用高分辨率混合四极杆-Orbitrap质谱仪对12个MS患者和12个健康对照者的脑脊液CSF进行分析发现，与对照组相比，MS患者的甘氨酸、不对称二甲基精氨酸（ADMA）、甘油磷脂PC-O（34∶0）和己糖的水平显著增加［20］。以上结果表明代谢组学是一种有效的方法，可能为该疾病提供新的生物标志物。

2.2发病机制方面目前为止，多种系统生物学方法已被应用于MS的研究，如基因组学、蛋白组学，并对该病的发病机制取得一定进展［21-24］，但关于其发病机制的看法仍不统一，所以需要更多的工具说明MS的确切发病机制。SINGH等［25］采用高效液相色谱和质谱联用技术，在MS动物模型中发现8种常见的代谢产物在病例和对照组的血液和尿液生物液体中均发生明显的改变，其中苯丙氨酸代谢紊乱，谷氨酰胺、亮氨酸和异亮氨酸代谢途径紊乱，参与中枢神经系统功能障碍。VANYSLADA等［26］使用基于质谱的非靶向代谢组学研究表明，大多数改变发生在脂类、能量代谢、脂肪酸代谢和磷脂代谢水平的改变。另一项研究确定了MS病例组和对照组的12种差异代谢物，其中6种AUC>80%，如焦谷氨酸、月桂酸酯。这些代谢物参与谷胱甘肽代谢、脂肪酸代谢/氧化、细胞膜组成和瞬时受体电位通道信号传导。基于每种代谢物的基因表达关联的途径分析表明，与细胞凋亡和线粒体功能障碍有关的途径富集。有趣的是，主要的MS遗传风险等位基因HLA-DRB1×15：01与6种最相关代谢物之一相关［27］。以上研究表明能量代谢、脂代谢、氧化应激等可能参与MS的发病机制。

2.3疾病分期或进展方面NOGA等［28］使用靶向液相-色谱质谱法（LC-MS）和气相-色谱质谱法（GCMS）研究了急性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）大鼠模型中的CSF代谢组，通过同时注射两种不同物质诱导大鼠急性EAE。在两个时间点收集CSF样品：接种后10 d（在疾病发作期间）和接种后14 d（在疾病高峰期）。与对照相比，EAE发作期间代谢组图谱显示精氨酸、丙氨酸和支链氨基酸水平显著降低。在疾病高峰期，观察到多种代谢物的浓度显著增加，包括谷氨酰胺、O-磷酸乙醇胺、支链氨基酸和腐胺。受影响的途径包括一氧化氮合成、能量代谢改变、多胺合成和内源性抗氧化剂的含量。EAE发作和高峰两个时间点获得的CSF代谢谱显示出明显的差异，表明在MBP诱导的神经炎症过程中CNS代谢发生显著变化，暗示进展型MS中氨基酸和核苷酸代谢与对照组或复发缓解型（RRMS）相比有差异，可以尝试通过代谢谱可区分不同时期MS。

DICKENS等［30］第一个使用血清NMR证明复发缓解型（RRMS）和继发进展型MS（SPMS）代谢物有差异，表明代谢物具有客观上区分MS的这两个阶段的潜力［29］。HERMAN使用质谱方法证明了SPMS相对于RRMS在脑脊髓液（CSF）中存在明显的代谢变化。FEDERICA等［31］采用磁共振（H-NMR）和质谱分析（结合气相色谱和液相色谱）对收集的34例患者的脑脊液和血液两种样本（RRMS 22例，PPMS 12例）进行分析发现，RRMS和PPMS的代谢物存在差异，可以鉴定出几种代谢产物的改变（脂质、生物胺和氨基酸），主要参与的代谢途径有谷胱甘肽代谢、氮代谢、谷氨酰胺-谷氨酸代谢、精氨酸-鸟氨酸代谢等。其中谷胱甘肽代谢和氮代谢与氧化应激密切相关。GAETANI等［32］利用质谱技术的研究也表明，稳定期MS患者和复发期MS患者的尿液中色氨酸代谢物有差异。这些发现显示出代谢组学在研究疾病不同分期及进展方面有很大的潜在价值。

2.4鉴别其他神经炎性疾病多发性硬化（MS）和一些其他的炎症性脱髓鞘疾病，如视神经脊髓炎（NMO），有时难以区分，会增加临床上的误诊率［33］。为了寻找MS可能的独特代谢方式和候选生物标志物，MOUSSALLIEH等［34］用质子磁共振光谱对47例MS患者、44例NMO患者和42位对照组患者血清进行代谢组学分析，结果表明鞘肌醇和乙酸盐分别是MS和NMO的可能血清生物标志物。与对照组相比，在87.8%的MS患者中鞘肌醇增加了0.15～3倍，而在74.3%的NMO患者中，乙酸盐增加了0.4～7倍，同时使用这两种代谢物可以区分MS患者和NMO患者（敏感性为94.3%，特异性为90.2%）。PARK等［35］采用质谱代谢物谱方法，从脑脊液样本中寻找多发性硬化（MS）、视神经脊髓炎（NMOSD）和特发性横脊髓炎（ITM）的差异代谢物，结果表明，脂类、1-单甘肽和1-单硬脂酸分别是MS、NMOSD和ITM的特异代谢物。FRENCH等［36］将1NMR代谢组学应用于莱姆病、西尼罗河病毒脑膜脑炎、多发性硬化等27例患者和25名健康对照者的CSF样品，结果表明MS与其他疾病存在差异代谢物。这些结果初步表明，代谢组学作为快速筛查测试可能具有区分其他神经炎性疾病的能力，从而增强诊断准确性的潜在作用。

2.5预测治疗反应方面MS是一种需要长期服药的疾病，且治疗费用较高。有些药物可能对某些患者无效，需要一种手段预测治疗的反应，避免无效治疗和不必要的花费。中和抗药物抗体（ADA）可大大降低用于治疗多发性硬化患者生物药物的疗效。使用β-干扰素（IFN-β）治疗的MS患者中，很多患者发展为ADA。一项研究对89例MS患者血清样本进行代谢组学分析，测定干扰素β治疗前后代谢产物和ADA的变化。成为ADA+的患者在前3个月对干扰素β有明显的代谢反应，有29种不同的调节代谢物，结果表明血清代谢物是预测干扰素β治疗的MS患者ADA发展的一个有前景的生物标志物［37］。一项研究确定IFN-ß对MS患者代谢组的影响，以探索可预测治疗反应的生物标志物。研究入选了21名开始接受IFN-ß治疗的MS患者（44μg，每周皮下注射3次），在基线水平和治疗6、12、24个月后获得血液样本，并通过高分辨率磁共振波谱分析代谢产物的变化。IFN给药后，根据“无疾病活动证据（无复发、残疾进展和磁共振成像活动），将患者分为应答者和无反应者。结果表明，有反应者和无反应者代谢物在乳酸、丙酮、3-OH-丁酸、色氨酸和葡萄糖水平方面的差异［38］。有研究评估了富马酸二甲酯（DMF）对MS患者代谢组学特征的影响，在开始DM之前和开始后6个月对18例MS患者的血浆使用代谢组学方法分析，磷脂、溶血磷脂和缩醛磷脂增加，循环游离脂肪酸减少。此外，脂肪酸水平的改变与淋巴细胞计数，特别是CD8+T细胞亚群之间观察到很强的相关性，表明DMF诱导的脂质代谢改变与免疫学变化有关［39］。总之，代谢组学方法似乎是一种有前途的工具，可能有助于预测MS治疗的效果，从而实现更精确的特异性治疗。

2.6治疗靶点方面在一项神经系统疾病的研究中描述了胆汁酸代谢异常［40］，这可能归因于胆汁酸通过调节神经炎症的神经保护作用。NOTIKO等［41］的研究表明MS患者血液中胆汁酸代谢异常。最近的一项研究也表明胆汁酸代谢在MS中发生了改变，且胆汁酸的补充阻止了星形胶质细胞和小胶质细胞的极化，使神经毒性表型和MS动物模型的神经病理学得到改善［42］。这些发现确定胆汁酸代谢失调是MS的潜在治疗靶点，但由于样本量小还需要更多的研究发现MS的治疗靶点。

2.7其他方面对于MS代谢组学的研究多采用脑脊液、血液、尿液等生物学基质。最近研究人员开发了一种新的LC-MS/MS方法，该方法可从眼泪中鉴定出极性脂质、酰基肉碱、游离肉碱和氨基酸，在MS患者中发现了30种泪脂生物标志物，其中一些还存在于这些患者的CSF中。此外，其眼泪中酰基肉碱水平显著增加［43］。这项研究表明其他基质也可以用于MS代谢组学的研究。

单一组学方法有各自的优势，但也有局限性。近几年一些学者开始用多组学方法预测与人类疾病相关的微生物功能和分子机制。基于气相色谱-质谱法的快速、高灵敏度的检测方法被用于脂肪酸的定量检测，是研究肠道微生物群落参与代谢途径的有效工具［44］。如最近利用16S rRNA测序和粪便代谢组数据，对RRMS、SPMS和与健康密切相关的疾病（HCS）患者的肠道微生物和代谢组进行比较。与HCS相比，每一患者组都有一些物种有明显的变化，包括短链脂肪酸（SCFA）产生菌在MS中减少。与HCS相比，RRMS中丁酸和丙酸的生物合成明显减少。硫代谢组学发现SPMS中半胱氨酸与半胱氨酸的比值增加，推测SPMS肠道内存在过量的DNA氧化。肠生态环境和功能微环境在MS的不同阶段发生了显著的变化，尤其是RRMS中SCFA的生物合成减少，SPMS中的氧化水平升高是其特征［45-46］。将代谢组学技术与肠道微生物整合，来自人类肠道的微生物群落的生物活性化合物参与了与宿主的微调互联网络，协调了各种生理过程。BLANCHET等［47］使用NMR代谢组学和蛋白质组学数据相结合，观察到EAE所致大鼠脑脊液能量供应和氨基酸代谢与T激肽原1、乳酸或肌醇、补体C3和铜蓝蛋白的解除有关，阐明了蛋白质组学和代谢组学的一种新的融合方法在EAE中的应用。这种多组学方法可能更好地了解疾病的病理生理及发病机制，制定新的治疗方案。多组学技术尚属于初步探索阶段，需要进一步进行研究。

3 结论与展望

代谢组学作为一种较为新兴的研究手段，发展已较为成熟，目前在MS血液、脑脊液等基质中的研究已相对较多。今后可能会需要更大的样本对MS的代谢组学进行研究，或探索性地在其他基质上进行研究，且随着检测技术和生物学技术的不断发展，将代谢组学技术与其他技术相结合将会成为研究MS的热点。