蛋白质腺苷化修饰研究进展

胡 阳,丁 明

（中国药科大学 生命科学与技术学院,江苏 南京 210009）

蛋白质是生命活动的“执行者”,对蛋白质功能的研究是生命科学领域的一大重点。蛋白质的功能不仅取决于翻译完成之后的蛋白质结构,也与蛋白质的翻译后修饰密切相关,例如蛋白质的磷酸化、泛素化、糖基化、甲基化、乙酰化、棕榈酰化等翻译后修饰机制已经被证明对于蛋白质正常生物学功能的发挥至关重要。蛋白质腺苷化修饰是指腺苷化酶以ATP为底物将腺苷一磷酸通过磷酸二脂键共价结合到蛋白质特定的氨基酸上,从而对蛋白质的功能进行调节。最常见且稳定的腺苷化修饰发生在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的侧链羟基上[1]。蛋白质的腺苷化修饰首先在原核生物中被发现,Stadtman实验室发现大肠杆菌中的氮环境发生改变时,一个未知的蛋白会将腺苷一磷酸连接到谷氨酰胺合成酶上,从而改变谷氨酰胺合成酶的催化活性[2]。但40年之后才出现关于新的腺苷化修饰的报道,科学家们发现病原微生物副溶血性弧菌的分泌蛋白VopS能够在真核生物中介导腺苷化修饰[3]。由于真核细胞中腺苷化修饰的发现,使得该翻译后修饰机制再度引起了科学家们的广泛关注。

1 原核生物中的蛋白质腺苷化修饰

原核生物中的腺苷化修饰对原核生物主要起到两方面作用,首先是维护原核生物自身的稳态。科学家们发现的第一个腺苷化酶是来自于大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶腺苷转移酶,谷氨酰胺合成酶以谷氨酸和氨离子为底物合成谷氨酰胺,为其他几种氨基酸和核苷酸的合成提供原料,谷氨酰胺合成酶腺苷转移酶通过腺苷化修饰和去腺苷化修饰调控谷氨酰胺合成酶的活性,对菌体中的氮代谢稳态具有重要意义[4-6]。Canhua Lu等将荧光假单胞菌中的FicT在大肠杆菌中表达之后发现FicT会腺苷化修饰DNA促旋酶的亚基GyrB,诱发SOS反应,抑制菌体DNA复制,特异性蛋白AntF是FicT抗毒性蛋白,能够抑制FicT的腺苷化修饰活性,两种蛋白组成的毒性-抗毒性分子对细菌DNA复制的调控具有重要意义[7]。FicT也能够腺苷化修饰荧光假单胞菌体内的拓扑异构酶IV ParE tyr109从而抑制ParE的活性,诱发SOS反应。FicT的上述生物学功能在假结核耶尔森菌和金黄色葡萄球菌中得到验证[8-9]。此外,沃尔巴克氏体中的FicT参与的腺苷化修饰过程可能与细胞生存压力的调节相关[10]。Sreelatha等发现大肠杆菌中的假激酶Selo是一种腺苷化酶,能够腺苷化修饰grxA Tyr13从而通过谷胱甘肽对大肠杆菌的氧化还原稳态进行调控[11-12]。

原核生物中腺苷化修饰的另一个生物学意义是通过对宿主细胞相关信号转导的劫持来促进病原体对宿主细胞的入侵。Yarbrough等通过研究表明副溶血性弧菌分泌的腺苷化酶VopS能够腺苷化修饰宿主细胞的GTPases家族蛋白Rac Thr35来抑制宿主细胞内肌动蛋白聚集,从而破坏宿主细胞的细胞骨架,促进副溶血性弧菌对宿主细胞的入侵[3]。与此同时,副溶血性弧菌分泌的腺苷化酶VopS也被证明能够通过腺苷化修饰抑制宿主细胞中的NF-KB、Erk和JNK信号通路来促进副溶血性弧菌对宿主细胞的入侵[13]。嗜肺军团菌的效应蛋白DrrA也是一种腺苷化酶,宿主细胞质中包含嗜肺军团菌的囊泡会通过DrrA招募宿主的Rab1b蛋白至囊泡周围,并对其进行腺苷化修饰,从而影响宿主细胞的囊泡运输功能,促进嗜肺军团菌对宿主细胞的入侵[14-15]。

2 真核生物中的蛋白质腺苷化修饰

现阶段,真核生物中只有FicD和SELO两种蛋白质被证实具有腺苷化修饰活性,FicD在寻找亨廷顿蛋白直接相互作用蛋白的酵母双杂交筛选实验中首次被发现,因此又被称为HYPE（Huntingtin yeast interacting protein E）[16]。FicD和其同源蛋白在结构上具有高度的保守性,均由一个N端跨膜结构域和一个C端I型Fic结构域组成,定位于内质网[17-19]。

科学家们对FicD的研究较为深入,但迄今为止FicD也只有HSPA5、HSP70、eEF1A、HSP40和αSyn 5种下游底物蛋白被发现。2014年,Ham等在黑腹果蝇的S2细胞中首次发现dFic对HSPA5的腺苷化修饰作用[17]。HSPA5定位于内质网腔内,是HSP70家族的一员,当内质网内出现未折叠蛋白反应（UPR）时,HSPA5能够抑制未折叠蛋白或错误折叠蛋白的集聚,从而保护细胞,而FicD则通过对HSPA5特定氨基酸位点的腺苷化修饰影响HSPA5的活性,从而参与到UPR中。现在已知FicD对HSPA5有3个特异性的氨基酸腺苷化修饰位点,分别是T518、S356和T366,不同位点的修饰对HSPA5功能的影响也不相同,T518的腺苷化修饰会抑制HSPA5在UPR中的活性[18,20],而S356和T366的腺苷化修饰则会增强HSPA5在UPR中的活性[21]。Matthias C.Truttmann等研究表明FicD能够腺苷化修饰HSP70从而抑制HSP70辅助蛋白正确折叠的功能[22]。与此同时,腺苷化修饰也被报道存在于帕金森综合征。Syn是一种突触蛋白,研究表明Syn蛋白的沉积会诱发帕金森综合征,Anwesha Sanyal等通过体外研究发现FicD能够腺苷化修饰Syn,减轻Syn沉积在细胞中诱发的相关表型[23]。与FicD相比,科学家们对SELO生物学功能的了解知之甚少。SELO是哺乳动物中25个含硒蛋白中最大的一个,在多种器官中表达并定位于线粒体。Sreelatha,A等报道了人源SELO蛋白晶体结构并揭示了一种蛋白激酶样折叠,因此他们推测SELO实际上是一种可以将AMP而不是磷酸基连接到特定蛋白质的Ser,Thr和Tyr残基上的活性酶,并在体外实验中证明SELO能够腺苷化修饰自身和MBP、在细胞的氧化应激反应中发挥至关重要的作用[11]。

3 蛋白质腺苷化修饰的检测方法

从腺苷化修饰发现至今,科学家们已经发展出多种检测腺苷化修饰的方法。在研究的早期,32P-α-labeled ATP被添加到腺苷化修饰体外实验体系中,当底物被腺苷化修饰时会被检测到放射性[3]。考虑到进行放射性实验需要专门的材料和处理,Daniel M.Lewallen等开发出可操作性更强的ATP类似物FL-ATP,FL-ATP的C6被荧光素标记,在免疫沉淀以及与质谱的联用实验中具有与32P-a-labeled ATP相似的效果[24]。Kathrin Pieles等在巴尔通氏体属的腺苷化酶BeP2所介导的体外腺苷化修饰实验中添加稳定同位素标记的ATP,而后结合质谱技术发现了新的靶蛋白Vimentin,并通过独立的实验对这一结果进行了验证[25]。与此同时,点击化学的方法也被广泛应用于蛋白质腺苷化修饰的检测。Markus Grammel等开发出带炔基的N6pATP,该检测方法的基本原理是将ATP类似物N6pATP掺入到重组腺苷化酶介导的腺苷化修饰反应,反应完成之后被N6pATP来源的AMP修饰的蛋白质在铜催化的条件下与带有叠氮基团的生物素进行叠氮-炔基环加成反应,进而被标记上生物素,avidin磁珠富集之后运用质谱技术即可找到被腺苷化修饰的蛋白[26]。但该检测方法也有一定的局限性,例如由于对细胞膜的透过性不高,因此不能用于生理条件下新的腺苷化修饰靶蛋白的发现。为了解决这一问题,Kielkowski等开发出新一代ATP类似物pro-N6pA,该类似物中带负电的磷酸基团被封闭,对细胞膜的透过性得到显著提高,进入细胞后会被切割成N6pATP,发挥与之相同的作用,pro-N6pA的开发使得生理条件下新的腺苷化修饰靶蛋白的发现成为可能。该团队还开发出另外一种ATP类似物pro-N6azA,该类似物的胞内衍生物在被修饰到靶蛋白之后进行的叠氮-炔基环加成反应中会使靶蛋白带上荧光标签,该荧光标签能稳定存在至少24小时,使得生理条件下观察腺苷化修饰的动态变化成为可能[27-28]。腺苷化修饰识别抗体的发展也备受关注。Yi-Heng Hao等以第35位苏氨酸被腺苷化修饰的Rac1为抗原来诱导产生兔源多克隆抗体,随后多克隆抗体被用于WB和免疫共沉淀实验,发现该多克隆抗体能够特异性较强地识别苏氨酸被腺苷化修饰的蛋白,因此具有被用于识别未知腺苷化修饰蛋白的潜能[29]。2020年,Dorothea HO¨pfner等开发出三种特异性识别腺苷化修饰而较少受肽段骨架影响的多克隆抗体,并在WB、ELISA、IP实验中对它们的效果进行了验证,虽然在WB实验中会出现交叉识别MARylation修饰的现象、在IP实验中不能很好地识别低丰度腺苷化修饰,但这三种抗体在腺苷化修饰靶蛋白识别中具有广阔前景[30]。最近,一些新的腺苷化修饰检测方法也相继被开发出来。Burak Gulen等人工合成了巯基反应核苷酸衍生物TReNDs,该衍生物能够替代ATP特异且稳定地与Fic腺苷化酶活性中心的半胱氨酸侧链巯基共价结合形成二元复合物FicTReND,接着捕捉Fic腺苷化酶的特异性底物,他们运用IbpA,BepA,FicD和他们已知的底物对这一方法进行了验证,找到已知底物的同时也发现了新的底物,他们称这种方法为“共沉淀介导的共价捕捉法”[31]。

4 讨论

随着越来越多的科学家关注腺苷化修饰,我们对腺苷化修饰的了解也在不断加深。到目前为止,在原核生物中发现了多种腺苷化酶,并识别到一些底物。但在真核生物中只发现了FICD和SELO两种腺苷化酶且已知的底物较少,特别是暂时没有发现SELO的腺苷化修饰底物。科学家们根据腺苷化酶中催化结构域的结构,对已知的腺苷化酶进行了详细的分类,对其催化和调控机制也进行了详细的描述,分析了原核生物中的腺苷化修饰对其自身生理稳态、辅助入侵宿主细胞具有的重要意义,阐述了真核生物中的腺苷化修饰在内质网未折叠蛋白反应、神经发育和神经退行性疾病中所扮演的角色。与此同时,科学家们也开发了多种检测方法用于腺苷化修饰的检测和腺苷化修饰新靶点的发现。但总的来说,相对于其他研究较为成熟的翻译后修饰,我们对腺苷化修饰的了解还相当匮乏。新的腺苷化酶、已知腺苷化酶的靶蛋白还有待进一步发掘,腺苷化修饰所参与的生物学过程有待进一步研究拓展,腺苷化修饰的检测方法还有待进一步开发,例如腺苷化修饰蛋白的富集方法的发现有利于整合提高质谱等高通量检测方式对腺苷化修饰蛋白的检测能力和可信度。总之,对腺苷化修饰相关问题的回答会进一步加深我们对生命过程的了解,为相关疾病的治疗提供坚实的理论依据。