基于SnO2/TiO2/AuNPs纳米复合材料发展光电化学方法特异性检测唾液酸

姚静静 杨宇 顾鑫鑫 钟琦 杨海峰 吴一萍

摘  要： 制备了氧化铟锡（ITO）/二氧化锡（SnO2）/二氧化钛（TiO2）/金纳米粒子（Au NPs）纳米复合电极（ITO/SnO2/TiO2/Au NPs），并利用它发展了可以选择性检测唾液酸（SA）的光电化学（PEC）法.采用旋涂法制备了ITO/SnO2电极，并通过静电纺丝和磁控溅射技术在ITO/SnO2表面原位合成了TiO2纳米纤维和Au NPs.与单纯SnO2比，ITO/SnO2/TiO2/Au NPs纳米复合电极的光电性能显著提高.这可能与Au NPs的局域表面等离子体共振效应（LSPR）和TiO2/SnO2异质结之间的协同作用密切相关.之后，通过金硫键（Au-S）将四巯基苯硼酸（4-MPBA）修饰在ITO/SnO2 /TiO2/Au NPs电极表面，利用4-MPBA和SA之间的非特异性酯化反应，发展了可以特异性检测SA的PEC传感平台.

关键词： 光电化学（PEC）法; 纳米复合材料; 葡萄糖氧化酶; 唾液酸（SA）

中图分类号： O 657.1    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2021）06-0663-09

Abstract： In this work， indium tin oxide（ITO）/tin oxide（SnO2）/titanium dioxide（TiO2）/gold nanoparticles（Au NPs） nanocomposite electrode（ITO/SnO2/TiO2/Au NPs） was prepared and used to develop a photoelectrochemical（PEC） method for the selective detection of sialic acid（SA）. Firstly， ITO/SnO2 electrode was prepared by spin coating method， and then TiO2 nanofibers and Au NPs were synthesized on the surface of ITO/SnO2 by electrospinning and magnetron sputtering. Compared with pure SnO2， the photoelectric performance of ITO/SnO2/TiO2/Au NPs nanocomposite electrode is significantly improved. This may be closely related to the local plasmon resonance effect（LSPR） of Au NPs， and the synergistic effect between TiO2/SnO2 heterojunction. After that， 4-mercaptophenylboronic acid （4-MPBA） was modified on the surface of ITO/SnO2/TiO2/Au NPs electrode by Au-S bond， and a PEC sensing platform was developed to specifically detect SA by non-specific esterification reaction between 4-MPBA and SA.

Key words： photoelectrochemical （PEC） method; nanocomposite materials; glucose oxidase; sialic acid（SA）

0  引 言

光電化学（PEC）分析是近年来发展起来的一种以PEC反应作为分析基础的新型传感模式.PEC结合了光化学和电化学的优势，以光作为激发信号，电为检测信号，结合循环放大策略，可以实现非常高的灵敏度.对于单一的宽带隙纳米半导体而言，由于能带间隙较宽，对可见光的利用率较低，加上光生载流子复合，整体光电转换效率不高.目前，研究者们提出了多种方法和策略来改善宽禁带纳米半导体材料的PEC特性，包括：1） 有机染料敏化[1-3];2） 与窄带隙纳米半导体耦合[4-6];3） 贵金属敏化[7].贵金属纳米粒子在可见光照射下具有局域表面等离子体共振效应（LSPR）[8-9]，该效应可以促进纳米半导体光生载流子的产生，提高光电转换效率.因此通过制备复合纳米材料，利用窄禁带纳米半导体或贵金属纳米粒子的局域表面等离子体共振效应，改善宽禁带半导体纳米材料的光电转化效率[10]，从而提高PEC检测方法的灵敏度.

唾液酸（SA），又名N-乙酰基神经氨酸[11]，广泛存在于生物体内细胞膜糖蛋白和脂蛋白中，并在生命活动过程中发挥着重要的作用[12-13].SA也是乳腺癌检测的生物标志物之一.在癌症恶性转化期间，微环境中糖基转移酶、糖苷酶和单糖转运蛋白的差异表达会导致组织糖基化水平发生变化，而SA含量的改变正是恶性组织糖基化水平发生变化的一个关键环节[14].因此，监测人体SA含量对早期癌症诊断具有重要辅助作用.目前检测人血清中SA的方法主要有：高效液相色谱（HPLC）法 [15]、荧光法[16]、高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法[17]和酶联免疫法[18].现有的HPLC法需要多个预处理步骤，操作复杂，费时费力;LC-MS/MS法对仪器要求高、成本高，且易发生基质诱导效应，高亲水性化合物，如碳水化合物，很难用正电喷雾质谱检测到;酶联免疫法灵敏度高，但其成本较高，操作方法较为复杂，线性范围较窄.本文作者运用PEC法对其进行检测，该方法具有灵敏度高、成本低、操作方法简单的优点.

通过静电纺丝和磁控溅射技术制备了稳定的氧化铟锡（ITO）/二氧化锡（SnO2）/二氧化钛（TiO2）/金纳米粒子（Au NPs）纳米复合电极（ITO/SnO2/TiO2/Au NPs）.与单一纳米材料比，该复合纳米材料在可见光区展现出较高的光电转换效率，这可能与Au NPs的LSPR及SnO2和TiO2之间匹配的能级密切相关.另外，通过金硫键（Au-S）将4-巯基硼酸（4-MPBA）自组装到该复合纳米电极表面，然后利用酯化反应将SA特异性捕获至电极表面;电极表面的光透性和电子转移效率随着4-MPBA-SA复合物的产生而下降，光电流随之有规律地降低，由此建立SA浓度与光电流强度间的相关性，发展可以特异性灵敏检测SA的PEC方法.

1  实验部分

1.1 化学试剂

四异丙醇钛（TTIP）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡萄糖（Glucose）、氯化钾（KCl）、氯化钠（NaCl）、乙酸、无水乙醇、4-MPBA、SA购自麦克林生物科技;3-巯丙基三甲氧基硅烷、三（2，2´-联吡啶钌）二（六氟磷酸盐）（Ru（bpy）32+）、抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）购自Adamas公司，均为分析纯;15%（质量分数）SnO2购自Alfa Aesar公司;ITO导电玻璃购于深圳伟光公司南玻有限公司.实验过程中用的水溶液均由18.25 MΩ·cm的超纯水配制而成，所有的试剂和化学品均直接使用，实验玻璃仪器均用王水（浓盐酸和浓硝酸体积比为3∶1混合）浸泡洗涤，再以二次去离子水冲洗.

1.2 实验仪器

场发射扫描电子显微镜（FE-SEM），日本日立仪器有限公司，S-4800型;透射电子显微镜（TEM），日本日立仪器有限公司，JEM-2100 EXII;便携式拉曼（Raman）光谱仪，Enwave Optronics，Prott-EZ-Raman-A2型;光电化学反应仪，天津艾达恒科技发展有限公司，PEAC 200A型;台式匀胶机，中国科学院微电子研究所，KW-4A型;电化学工作站，海辰华仪器有限公司，CHI440D;紫外-可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司，UV-7504PC型;X射线光电子能谱（XPS）仪，日本岛津公司，Axis 165型;离子溅射仪，TED PELLA，INC.，CPC 108 auto;陶瓷纤维马弗炉，上海慧泰仪器制造有限公司，8-12T/TP;纯水仪，上海淼康实业有限公司，Milli-Q;干燥箱，上海慧泰仪器制造有限公司，DZF-6000.

1.3 ITO/SnO2电极制备

将ITO导电玻璃切成5 cm×5 cm大小，按照以下顺序依次在超声波清洗仪中进行洗涤：含一定浓度洗涤剂的水溶液（15 min），去离子水（5 min，2次），丙酮（5 min），异丙醇（5 min），去离子水（10 min，2次）.清洗完之后將ITO玻璃放置在鼓风干燥箱中于80 ℃烘干.ITO/SnO2纳米电极的制备：将ITO导电玻璃固定在旋涂仪上，取70 μL的10%（质量分数）SnO2纳米水溶胶均匀地旋涂在ITO导电玻璃上.待自然风干后，放置于马弗炉，450 ℃煅烧1.5 h，自然冷至室温，待用.

1.4 ITO/SnO2/TiO2/Au NPs复合电极的制备

取1 g PVP加入3.2 mL无水乙醇中，磁力搅拌下形成黏稠白色溶液;取1 mL TTIP加入6.4 mL乙酸和无水乙醇（体积比为1∶1）的混合液中，在磁力搅拌下于另一个烧杯中溶解;等该溶液透明后，将其加入至PVP黏稠液中继续搅拌，搅拌5 h，制得静电纺丝前驱液.接着进行电纺，电纺条件为：电压24 kV，接收装置与针头之间距离为15 cm，收集器为上述所制备得到的ITO/SnO2玻璃片，前驱液流速为0.2 mL·h-1，时间为30 min.电纺后将玻璃片自然风干，放置于马弗炉中，于450 ℃煅烧1.5 h，自然冷却.将制备好的玻璃片浸没在5%（质量分数）的3-巯丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中24 h，冲洗干净，氮气（N2）吹干后，将该玻璃片置于离子溅射仪中，设置喷金时间为10 s（经优化后的时间），最终成功制备复合纳米电极，记为ITO/SnO2/TiO2/Au NPs.

1.5 PEC传感器构建

将上述制备的ITO/SnO2/TiO2/Au NPs电极切至2.5 cm×0.5 cm大小，将10 μL 4-MPBA溶液滴涂在ITO/SnO2/TiO2/Au NPs电极表面，滴涂面积为电极底部0.5 cm×0.5 cm处，在室温条件下孵育2 h.随后，用乙醇、超纯水对修饰的电极进行清洗，N2吹干，待用.

1.6 电化学阻抗表征

通过CHI660D电化学工作站对ITO/SnO2/TiO2/Au NPs电极的修饰过程进行电化学阻抗表征.以含有5.0 mmol·L-1[Fe（CN）6]3-/4-（1∶1）的0.1 mol·L-1 KCl溶液作为阻抗液（pH=7.0），频率范围为0.1 Hz～100 kHz，振幅为50 mV.三电极体系分别为：ITO修饰电极为工作电极，铂（Pt）丝电极为对电极，银/氯化银（Ag/AgCl）（3 mol·L-1 KCl）为参比电极.

1.7 PEC检测

光电测试在CHI440C电化学工作站上进行.电解液为10 mmol·L-1磷酸缓冲液（PB）缓冲液（pH=7.2）.三电极体系分别为：ITO修饰电极为工作电极，Pt丝电极为对电极，Ag/AgCl（3 mol·L-1 KCl）为参比电极.检测偏压为+0.4 V.激发光源为波长473 nm的自制发光二极管.

1.8 实际样品检测

1 mL肺癌患者血清中加入4 mL甲醇，6 000 r·min-1转速下离心10 min去除蛋白质，然后N2吹干，样品最终体积为1 mL.将1 mL葡萄糖氧化酶溶液（1 mg·mL-1）加入1 mL样品中，于37 ℃孵育2 h以去除葡萄糖.

2  结果与讨论

2.1 ITO/SnO2/TiO2/Au NPs电极表征

分别利用FE-SEM和TEM对所制的ITO/SnO2，ITO/SnO2/TiO2和ITO/SnO2/TiO2/Au NPs电极表面形貌进行表征.ITO电极表面经过烧结之后形成致密的SnO2膜，如图1（a）所示.ITO/SnO2/TiO2的表面形貌如图1（b）所示，通过静电纺丝制备的TiO2纳米纤维覆盖在ITO/SnO2表面，交织在一起，形成三维网状结构，其中TiO2纳米纤维平均直径约为200 nm.图1（c）是ITO/SnO2/TiO2/Au NPs复合纳米材料的TEM图，右上角是放大图，可以清晰地看到Au NPs分散负载在TiO2纳米纤维表面.图2为ITO/SnO2/TiO2/Au NPs复合材料的能谱分析结果，表明了该复合材料中含有Sn，Ti，O和Au元素，且各元素的分布与电镜形貌相匹配，再次证明了电极表面SnO2纳米膜、三维TiO2纳米纤维网以及Au NPs的成功制备.

2.2 ITO/SnO2/TiO2/Au NPs/4-MPBA的Raman表征

表1是4-MPBA分子的Raman和表面增强拉曼散射（SERS）谱峰归属[19]，图3是电极表面组装4-MPBA前后的Raman光谱响应.比较后发现，组装有4-MPBA的电极表面在2 561 cm-1和907 cm-1处并没有出现归属于氢硫键（-SH）拉伸和碳碳巯基（-CSH）面内弯曲模式的Raman响应，表明4-MPBA可能以硫醇盐形式解离吸附在电极表面.另外，在1 092 cm-1处，归属于苯环与碳硫键（-CS）拉伸模式的Raman响应在电极表面向低波数移至1 070 cm-1，并大大增强，表明4-MPBA分子可能垂直组装在Au NPs表面，形成类似苯硫醇的单分子膜[20].4-MPBA分子在电极表面形成单分子层，加上-SH和二羟基硼（-B（OH）2）的对位取代关系，导致在1 300～1 050 cm-1范围内与分子平面内运动有关的峰被增强;同时，在850～620 cm-1范围内，与碳氢（-CH）摇摆振动和环形平面外振动相关的一些峰也被放大;而在1 310，1 345和1 370 cm-1处，归属于硼氧（-BO）拉伸振动的响应却基本消失，表明硫醇共轭苯的电荷转移有助于硫醇化合物特征峰之外其他峰的增强[21].

2.3 电化学阻抗表征

电化学阻抗谱（EIS）可以有效表征电极表面的修饰过程.图4显示了PEC传感器构建过程中涉及阻抗的变化.阻抗图中半圆直径的大小反映的是层层修饰电极内阻（Ret）的变化，半圆直径越大内阻越大.ITO/SnO2电极显示出较小的Ret.随着TiO2修饰，Ret变小，表明TiO2纳米纤维的修饰有助于表面电子的传递;当继续修饰Au NPs后，Ret反而变大了，这可能与非导电的硅烷化膜有关.硅烷化膜的修饰是为了通过巯基在电极表面更加牢固地固定Au NPs，但它的存在也降低了电极电子传输能力.随后，在ITO/SnO2/TiO2/Au NPs表面逐步引入4-MPBA和SA，可以看到随着这些小分子的加入，电极Ret不断增加.同时随着SA的加入，阻抗增大，也证明了4-MPBA与SA之间识别作用的存在，表明该传感模式的成功构建.

2. 4 实验条件优化

偏压、Au NPs的负载量和4-MPBA修饰的物质的量浓度对传感器性能都具有显著的影响，因此对这几个参数进行了优化.光电测定在10 mmol·L-1 PB缓冲液（pH=7.2）中进行，激发光源为波长473 nm的蓝光.结果表明：随着偏压的增加，ITO/SnO2/TiO2/Au NPs电极的光电流逐渐增大.偏压为0.4 V时，光电流趋于稳定，如图5（a）所示.Au NPs的负载量，可通过控制喷金时间来优化.当喷金时间为10 s时，电极的光电流值达到最大，如图5（b）所示.因此，在随后的检测实验中偏压和喷金时间分别设定为0.4 V和10 s.对4-MPBA物质的量浓度进行优化时发现，光电流响应随着4-MPBA物质的量浓度的增加而下降，最后在800 μmol·L-1时趋于稳定，表明此刻电极表面4-MPBA组装达到饱和，如图5（c）所示.因此，之后4-MPBA修饰的物质的量浓度固定为800 μmol·L-1.

2.5 线性检测

在最优条件下，对SA进行定量检测.图6显示了不同物质的量浓度SA在ITO/SnO2/TiO2/Au NPs/4-MPBA上的响应.从图6（a）可以看出，随着物质的量SA浓度的增加，光电流减小，说明有更多的SA分子被捕获并参与了PEC过程.此外，光电流响应与SA物质的量浓度在100～700 μmol·L-1范围内成正比，相关系数R2为0.983 4，如图6（b）所示.

2.6 传感器的选择性和与稳定性考察

为了考察该PEC传感器的选择性，对样品中可能存在的干扰进行了考察.考虑到检测的实际样品为血液，所以重点对血液中存在的AA、NaCl、KCl、葡萄糖和UA对传感器选择性的影响进行了考察，结果如图7（a）所示.结果表明：这些物质对SA的PEC检测都不会造成干扰.光电流只有在SA溶液中才表现出明显的下降，证明该传感器抗干扰能力强，对SA具有良好的选择性.值得一提的是，在考察葡萄糖对传感检测的干扰时，预先在葡萄糖溶液里加入了葡萄糖氧化酶，通過酶促反应转化葡萄糖，保证传感器对血液中SA检测的特异性.另外，也同时考察了ITO/SnO2/TiO2/Au NPs电极在10 mmol·L-1 PB缓冲液中“开-关”循环光照下的光电流响应.如图7（b）所示，连续测试600 s后，光电流响应没有明显变化，证明电极的稳定性良好.

2.7 实际样品分析

根据实验部分所描述的，首先对获得血样进行了前处理.之后，将样品分为2份，一份（样品1）采用制备的传感器对其中的SA进行了测定，另一份（样品2）用高效液相色谱（HPLC）进行测定，样品1和样品2的PEC检测结果分别为0.138 mmol·L-1和0.208 mmol·L-1，HPLC检测结果分别为0.146 mmol·L-1和0.220 mmol·L-1.PEC检测血清SA水平与UPLC标准法[15]检测结果相似，证实了PEC传感器对血样中SA检测的准确性.与UPLC比，该方法更简便快速，检测成本也较低，具有较好的实际应用前景.

3  結 论

基于制备的ITO/SnO2/TiO2/Au NPs纳米复合材料，发展了一种非常简单的可用于血清中SA检测的PEC生物传感平台.这种基于ITO/SnO2/TiO2/Au NPs纳米复合电极构建的SA光电传感器具有优于其他SA光电传感器的传感特性，主要归因于：1） Au NPs产生的LSPR增强了对可见光的转换效率;2） SnO2/TiO2界面形成的异质结构加速了光生电子转移速率，有效地抑制了电子-空穴对的复合率;3） 电极表面修饰的4-MPBA与SA之间的非特异性酯化反应，在葡萄糖氧化酶存在的情况下，可以有效排除葡萄糖的干扰，实现对SA的选择性检测.该纳米复合电极具有良好的生物相容性、低毒性，并且可以实现在可见光下激发，在构建生物传感领域具有广阔的应用前景.

参考文献：

[1] YAO S， LAURENT C A， ROH J M， et al. Serum bone markers and risk of osteoporosis and fragility fractures in women who received endocrine therapy for breast cancer： a prospective study [J]. Breast Cancer Research and Treatment，2020，180（1）：187-195.

[2] CHANTADA-VÁZQVEZ M O P， LOPEZ A C， VENCE M G， et al. Proteomic investigation on bio-corona of Au， Ag and Fe nanoparticles for the discovery of triple negative breast cancer serum protein biomarkers [J]. Journal of Proteomics，2020，212：103581.

[3] PEARCE O M， LAUBLI H. Sialic acids in cancer biology and immunity [J]. Glycobiology，2016，26（2）：111-128.

[4] KIKKERI R， PADLER K V， DIAZ S， et al. Quantum dot nanometal surface energy transfer based biosensing of sialic acid compositions and linkages in biological samples [J]. Analytical Chemistry，2013，85（8）：3864-3870.

[5] SUN H， ZHOU Y， SKARO M F， et al. Metabolic reprogramming in cancer is induced to increase proton production [J]. Cancer Research，2020，80（5）：1143-1155 .

[6] ZUO G， LI B， GUO Z， et al. Efficient photocatalytic hydrogen peroxide production over TiO2 passivated by SnO2 [J].Catalysts，2019，9.DOI：10.3390/catal9070623.

[7] ARIENZON D M， ARMRLAO L， CACCIAMANI A， et al. One-step preparation of SnO2 and Pt-doped SnO2 as inverse opal thin films for gas sensing [J]. Chemistry of Materials，2010，22（13）：4083-4089.

[8] DUAN J， ZOU S， YANG C， et al. Full SnO2 double-layer dye-sensitized solar cells： slowly increasing phenomenon of power conversion efficiency [J]. Solar Energy，2020，196：99-106.

[9] NEU J， OSTRESH S， REGAN K P， et al. Influence of dye sensitizers on charge dynamics in SnO2 nanoparticles probed with THz spectroscopy [J]. The Journal of Physical Chemistry C，2020，124：3482-3488.

[10] QIAO F， XIE Y， HE G， et al. Light trapping structures and plasmons synergistically enhance the photovoltaic performance of full-spectrum solar cells [J]. Nanoscale，2020，12（3）：1269-1280 .

[11] HU M， ZHANG L， SHE S， et al. Electron transporting bilayer of SnO2 and TiO2 nanocolloid enables highly efficient planar perovskite solar cells [J]. Solar RRL，2020，4（1）：1900331.

[12] LIU Y C， YU M M， CHAI Y F， et al. Sialic acids in the immune response during sepsis [J]. Frontiers in Immunol，2017，8：1601.

[13] KIKKERI R， PADLER K V， DIAZ S， et al. Quantum dot nanometal surface energy transfer based biosensing of sialic acid compositions and linkages in biological samples [J]. Analytical Chemistry，2013，85（8）：3864-3870.

[14] SUN H， ZHOU Y， SKARO M F， et al. Metabolic reprogramming in cancer is induced to increase proton production [J]. Cancer Research，2020，80（5）：1143-1155 .

[15] DESGAYES S， SHE S. Phenylboronic acid-installed polymeric micelles for targeting sialylated epitopes in solid tumors [J]. Journal of the American Chemical Society，2013，135（41）：15501-15507.

[16] MARTN M J， VAZQUEZ E R R. Application of a sensitive fluorometric HPLC assay to determine the sialic acid content of infant formulas [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，387：2943-2949.

[17] FLANGEA C， FABRIS D，VUKELIC A D. Mass spectrometry of gangliosides from human sensory and motor cortex [J]. Australian Journal of Chemistry，2013，66：781-790.

[18] MARTIN H， MUNOZ M， DAURY C W. Immunochromatographic lateral-flow test strip for the rapid detection of added bovine rennet whey in milk and milk powder [J]. International Dairy Journal，2017，19：205-208.

[19] SUN F， BAI T， ZHANG L， et al. Sensitive and fast detection of fructose in complex media via symmetry breaking and signal amplification using surface-enhanced Raman spectroscopy [J]. Analytical Chemistry，2014，86（5）：2387-2394.

[20] HAN S W， LEE S J， KIM K. Self-assembled monolayers of aromatic thiol and selenol on silver： comparative study of adsorptivity and stability [J]. Langmuir，2001，17（22）：6981-6987.

[21] MOSKOVITS M. Surface-enhanced spectroscopy [J]. Reviews of Modern Physics，1985，57（3）：783.

（責任编辑：郁慧，包震宇）