苯并[a]芘复合降解菌群的构建

蔡言红,孙先锋,周立辉,张琪雯,柴晓蝶,韩宇星

(1.西安工程大学 环境与化学工程学院,陕西 西安 710048;2.长庆油田分公司 油气工艺研究院,陕西 西安 710055)

0 引 言

落地油泥是指在原油开采或运输过程中没有进入集输管线而散落在采油区地面的原油或从石油管线中泄漏并散落在地面上的石油所形成的污染土壤。由于落地油泥中的多环芳烃类物质苯并[a]芘具有难以降解、存留周期长、毒性较大的特点,一旦进入环境,对土壤和生态环境将会造成极大的危害。落地油泥中的苯并[a]芘是由5个苯环组成的一种多环芳烃,为黄色针状结晶体,分子式为C20H12,熔点179 ℃,沸点496 ℃,不溶于水,易溶于苯、乙醚、丙酮等有机溶剂[1-2]。苯并[a]芘分布广泛,性质稳定,致癌性极强,被世界卫生组织确定为一级致癌物质[3-4],因此已成为目前国内外环境监测方面重点关注问题[5-6]。有关文献[7-8]研究表明,微生物会产生多种可以催化苯并[a]芘降解的酶类,且代谢速率较高。李凤梅等研究发现,细菌可以通过代谢的方式以PAHs为碳源满足自身生长需求,但仅靠单一菌株很难完全降解,复合菌群的生物量和降解效果远优于单菌,尤其是对高环PAHs的矿化作用[9]。构建复合菌群是提高苯并[a]芘降解率的关键[10-11]。相关研究显示：① 复合菌群中各降解菌株，能提高对苯并[a]芘基质的利用效率和范围[12-13],从而实现对污染物的高效降解[14-15];② 复合菌群可以增加可降解底物的种类,并形成共生和共代谢系统[16-17];③ 较佳复合比例可以提高不同功能菌株之间相互协同作用。

本文以实验室自主筛选并保存的优势多环芳烃降解菌株为基础,构建可用于降解苯并[a]芘的复合菌群,研究各菌株对苯并[a]芘降解性能,为后期实现微生物复合菌群对多环芳烃的高效降解和有效去除提供参考。

1 实 验

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器 SW-CJ-1FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),YXQ-LS型立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司),THZ-82培养箱(PCECLSION),SF-TGL-16M高速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司),FA 1204B分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司),HZQ-R恒温振荡箱(哈尔滨市东联电子有限公司),7890A-5975C气质联用仪(美国安捷伦公司),SP-754紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。

1.1.2 菌株来源 前期经过落地油泥中菌株筛选、驯化、酶活性及其对苯并[a]芘降解、拮抗作用等一系列探究，已经从9株菌中筛选出来生长周期相似，具有较高脱氢酶活性和双加氧酶活性，对苯并[a]芘具有较高降解能力且相互之间无拮抗作用的优势多环芳烃降解菌，即YH-4假单胞菌属(pseudomonassp.)、YH-6葡萄球菌属(staphylococcussp.)和Da-6黄单胞菌属(santhomonassp.)等。

无机盐液体培养基:NH4NO32.0 g,K2HPO41.0 g,KH2PO40.5 g,无水CaCl20.02 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NaCl 5.0 g,蒸馏水1 000 mL,pH为7.0,121 ℃,灭菌20 min。

牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL,pH7.0,121 ℃,灭菌20 min。

苯并[a]芘液体培养基:取所需量的苯并[a]芘-丙酮浓缩液加入到灭菌后冷却至40 ℃左右的无机盐液体培养基中,使其质量浓度为50 mg/L,摇匀,等到丙酮挥发后待用。

苯并[a]芘固体培养基:在每升苯并[a]芘液体培养基中加入20 g琼脂,121 ℃,灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 降解菌的驯化 研究表明,经过驯化的菌株降解能力会明显增强,直至达到稳定的最大耐受浓度[18]。本实验以苯并[a]芘为唯一碳源,逐步提高碳源浓度,对降解菌进行驯化。取3株(YH-4、YH-6、Da-6)菌株，在牛肉膏蛋白胨液体培养基中扩大培养后制备菌悬液。分别取5%菌悬液接入质量浓度为10 mg/L苯并[a]芘液体培养基中,在35 ℃、120 r/min震荡器上震荡培养,1个周期(7 d)后,从驯化体系中取出5%培养液继续加至质量浓度为20 mg/L苯并[a]芘液体培养基中。依此类推,每个周期苯并[a]芘按照10 mg/L的质量浓度递增,共培养4个周期。分别在驯化前期和驯化后期,取1 mL培养液,稀释涂布,35 ℃避光培养48 h后进行平板计数[19]。

1.2.2 降解菌的降解特性 向各灭菌后的100 mL锥形瓶中分别加入50 mL苯并[a]芘液体培养基,使液体中苯并[a]芘质量浓度稀释至30 mg/L。同时，向不同锥形瓶中分别接入200 μL处于对数期的各降解菌菌悬液,在35 ℃、120 r/min条件下培养。分别在培养第2、4、6、8、10、12 d时，用GC-MS测定锥形瓶中苯并[a]芘降解率变化,采用紫外分光光度计法测定菌株的OD600值。具体提取和测定方法如下:①将液体培养基中的菌液加入30 mL二氯甲烷-丙酮(1∶1)混合溶液后转移100 mL离心管中,在6 000 r/min的转速下离心10 min;②离心结束后,将上清液倒进旋转蒸发瓶中,用旋转蒸发仪将上清液浓缩至约1 mL;③加入约3 mL正己烷,再浓缩至1 mL以下;④将溶剂完全转换为正己烷,并准确定容至1 mL于安捷伦瓶中,用GC-MS测定。

GC-MS测定条件为:

1)色谱条件：进样口温度280 ℃;进样量1 μL,不分流进样;柱流量1.0 mL/min(恒流);柱温70 ℃保持2 min,以10 ℃/min速率升至120 ℃,保持0 min;再以6 ℃/min速率升至300 ℃,保持25 min。

2)质谱条件:电子轰击源EI;离子源温度230 ℃;离子化能量70 eV;质量扫描范围45～450 amu;溶剂延迟时间5 min;数据采集方式为全扫描模式。

1.2.3 响应面法构建复合菌群 分别以菌株YH-4、YH-6和Da-6的接种量(1%、1.5%、2%等3个接种水平)为自变量,以苯并[a]芘的降解率为响应值,设计如表1所示的响应面实验。

表1 响应面实验设计

2 结果与讨论

2.1 降解菌驯化结果

微生物对所处环境有一定的适应能力,通过驯化,可以提高微生物适应逆境的能力及对难降解物的降解能力。按照1.2.1方法,对YH-4、YH-6和Da-6进行驯化培养,不同的苯并[a]芘驯化浓度下各菌株数量变化如图1所示。

(a)YH-4 (b)YH-6 (c)Da-6

从图1可以看出,随着苯并[a]芘浓度增加,YH-4、YH-6和Da-6等3株降解菌最大数量均逐渐降低,当苯并[a]芘质量浓度达到50 mg/L时,各菌株均难以生长。表明苯并[a]芘对微生物生长起到了显著的抑制作用。当苯并[a]芘质量浓度≤40 mg/L时,各菌株菌数均能达到106以上,满足基本的微生物降解活性需求。可见,降解菌YH-4、YH-6、Da-6具有良好的苯并[a]芘耐受能力,耐受质量浓度最大达40 mg/L。

2.2 单一菌对苯并[a]芘降解能力

为了解单一菌株对苯并[a]芘的降解能力,分别将YH-4、YH-6、Da-6接种在苯并[a]芘质量浓度为30 mg/L的液体培养基中进行培养,定时检测苯并[a]芘含量变化,计算出对应的降解率,结果如图2所示。

图2 单一降解菌对苯并[a]芘的降解曲线

图2中3条曲线趋势相近,均为先快速上升,再趋于平缓。表明3株降解菌均对苯并[a]芘有一定的降解能力,且随着时间的变化，降解率先升高,后平稳。在第8 d,菌株Da-6对苯并[a]芘的降解率最高,为50.17%。这一数据也是3株菌降解率最高的,但效果不理想。这是由于苯并[a]芘具有5个环的稳定结构,属于难降解有机物,仅靠单一菌株难以实现对苯并[a]芘的有效去除。

2.3 响应面法构建复合菌群

复合菌群中各菌株间的最佳配比可以大大提高不同功能菌株之间相互协同作用,进而扩大多环芳烃的利用范围和降解效率,还可有效避免当前以菌种开发为主要研究方面的偶然性和随机性[20]。以苯并[a]芘降解率为响应值进行响应面设计实验(表1),采用Design Expert 8.0.6软件对实验数据进行分析,结果见表2,方差分析结果见表3。

表2 响应面实验结果

表3 方差分析结果

(P<0.01)。

由表2、3可知,回归模型的P<0.000 1,表明该模型极显著(P<0.01)。A、B、C、AB、BC、A2、C2均对菌落数量有显著影响(P≤0.05),而且影响顺序依次为C>A>B,交互项AC、B2对菌数的影响不显著(P>0.05),表明实验因素对响应值的影响为二次关系,苯并[a]芘降解率(Y)回归方程为

Y=65.07+2.65A+1.31B+2.79C+

1.84AB-0.57AC-0.21BC-

4.30A2-1.60B2+2.18C2

失拟项P=0.173 8>0.05失拟不显著,此模型选择正确。该模型R2=0.974 1,说明回归方程的拟合程度较好,可以应用于3株降解菌接种量的理论预测。

图3是不同因素交互作用对苯并[a]芘降解率的影响。从苯并[a]芘降解率影响来看:菌株YH-4接种量与YH-6接种量的P=0.007 3,且曲面陡峭,影响极显著(P<0.01);菌株Da-6和YH-6接种量的P=0.044 5<0.05,对苯并[a]芘降解率影响显著。

(a)YH-4与YH-6交互

综合方差和响应面立体分析校正计算结果,YH-4、YH-6、Da-6按照最佳接种量1.4%、1.4%、1.8%构建复合菌群。菌株的安全性参照NY 1109—2006《微生物肥料生物安全通用技术准则》标准要求,构建复合菌群所用的菌株均属于该标准规定的范畴之内,可以安全使用,并不会对人畜和环境造成生物安全风险。

2.4 复合菌群对苯并[a]芘的降解

为验证复合菌群降解能力,以YH-4、YH-6和Da-6所构建的复合菌群对质量浓度为30 mg/L的苯并[a]芘进行降解实验。苯并[a]芘降解过程色谱图变化如图4所示。

图4 复合菌群对苯并[a]芘的降解色谱图

图4横坐标为苯并[a]芘的出峰时间,纵坐标为丰度值，是0、2、4、6、8、10、12 d加入复合菌群后,在培养第0、2、4、6、8、10、12 d后苯并[a]芘丰度的变化。可以看出：随着时间的增加,苯并[a]芘丰度(即苯并[a]芘的含量)逐渐降低；第12 d和第10 d的色谱曲线基本重合,即含量基本保持不变,表明复合菌群在12 d内实现了对苯并[a]芘的良好去除。

复合菌群降解实验过程中,质量浓度为30 mg/L的苯并[a]芘降解率变化及培养液OD600值变化情况见图5。

图5 复合菌群对苯并[a]芘的降解

图5表明,在复合菌群作用下,苯并[a]芘降解率和培养液OD600值均呈现显著上升趋势。复合菌群对苯并[a]芘的降解率最高为71.23%,远高于图2中单一菌株的最高降解率50.17%,说明3株菌同时存在提高了苯并[a]芘的降解率,降解效果明显优于单一菌株。培养液OD600值可以反映菌株以苯并[a]芘为碳源的生长繁殖情况,该数值越大,表明体系中的微生物数量越多,微生物越适应此生长环境,对碳源的降解能力越强。图5中前10 d OD600随着时间的增加逐渐增大,10 d后开始趋于平缓,OD600最大达到0.42,说明复合菌群在自身生长繁殖的同时有效去除了体系中的苯并[a]芘。

3 结 论

1)将菌株YH-4、YH-6、Da-6进行苯并[a]芘培养基驯化培养后,各菌株对苯并[a]芘耐受能力得到了显著提升,最大耐受质量浓度均可达40 mg/L,其抗逆能力明显提高。

2)以苯并[a]芘降解率为响应值,构建复合菌群。构建的复合菌群提高了对苯并[a]芘的降解率,为后期实现微生物复合菌群对多环芳烃的高效降解和有效去除提供帮助。