免疫胶体金技术在临床检验中的应用研究进展

天津市东丽区东丽医院（300300）孙利伟

免疫胶体金技术是氯金酸在还原剂作用下聚合成金颗粒，由静电作用形成一种稳定的胶体状态，即胶体金，以此作为示踪标志物用于抗原抗体的免疫标记技术[1]。胶体金自1971年作为免疫标记物被Faulk和Taylor引入免疫化学，1989年后免疫胶体金快速检验技术得到快速发展[2]。免疫胶体金技术不需使用特殊设备、仪器，成本低，无特殊环境要求，且所有反应均能在15min内完善，可适应多种检测条件，便于现场、基层使用，在激素、病毒、细菌、微生物、血清标志物等检测中得到广泛应用。现就其基本原理、制备方法、应用情况等进行一一介绍。

1 免疫胶体金技术的基本原理

免疫胶体金技术主要利用金颗粒的高电子密度特性，在弱碱环境下带负电荷，能够与蛋白质分子正电荷基团形成牢固结合，于显微镜下能见到黑褐色的颗粒状，当标记物大量聚集时，肉眼即可见粉红或红色斑点。同时胶体金与蛋白质分子之间的结合为静电结合，不会对蛋白质生物特性造成影响，稳定性较高。根据胶体金的高电子密度、形状、颗粒大小、颜色反应等物理性状，以及生物学特性，不仅能与蛋白质结合，还可与免疫球蛋白、葡萄球菌A蛋白、毒素、糖蛋白、酶、激素等结合，并能够根据胶体金的大小展现出不同颜色，广泛地应用于病理学、免疫学、细胞生物学、组织学等领域。

2 制备方法

2.1 胶体金颗粒制备 根据选择的还原剂不同，可制备出不同大小的胶体金颗粒，常用制备方法主要包括鞣酸-枸橼酸钠还原法和枸橼酸三钠还原法。鞣酸-枸橼酸钠还原法主要用于5nm直径的胶体金颗粒制备。枸橼酸三钠还原法则可根据制备过程中枸橼酸三钠水溶液加入量、煮沸时间的不同获得不同大小的胶体金颗粒，主要包括10nm、15nm、18nm、20nm、30nm、50nm等不同直径的胶体金颗粒。制备过程中应彻底清洗所需使用的玻璃器皿，最好经硅化处理，以免影响活化后金颗粒或金颗粒与生物大分子结合的稳定性。配置所使用的还原剂质量要求上乘，试剂配置保持严格纯净，以最大程度避免混入杂质，保障胶体金制备质量。

2.2 蛋白制备 胶体金对蛋白的吸附作用与pH值相关，若蛋白质的等电点高于胶体金pH值时，则会失去结合能力，故蛋白质的分子量会对胶体金与蛋白质的结合造成明显影响。在待标记蛋白溶液准备时需根据标记蛋白需求调节胶体金pH值，并在结合过程中加入一定量稳定剂，以防胶体金与抗体蛋白聚合发生沉淀。胶体金标记蛋白纯化包括凝胶过滤法和超速离心法，凝胶过滤法主要用于以血清蛋白作稳定的胶体金蛋白结合物的纯化，超速离心法可根据不同大小的胶体金颗粒选择不同的离心速度和离心时间。纯化处理后可根据胶体金颗粒平均直径测量及胶体金溶液的OD520nm值测定进行胶体金蛋白结合物质量测定，以保障胶体金蛋白结合物制备质量。

3 常用的免疫胶体金检测技术

由于胶体金作为标记物制备简便，敏感性、特异性高，无需使用放射性同位素或酶显色底物，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，还可应用于各种液相、固相免疫分析，以及流式细胞术等。液相免疫测定是将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原。胶体金固相免疫测定主要是将斑点酶联免疫吸附试验与胶体金相结合，将胶体金标记作为第二抗体，通过金颗粒聚集反应形成肉眼可见斑点，便于临床观察。金标记流式细胞术则是利用胶体金改变红色激光散射角，达到放大散射角的目的，且不会影响细胞活性。此外，胶体金与荧光素共同使用时彼此之间互不干扰，效果稳定。

4 临床应用

4.1 定性检测 定性检测是临床检测方法的一种，主要通过检测某种抗体、抗炎是否存在，判断是否有疾病。目前应用于定性检测的主要为斑点金免疫渗滤测定法和胶体金免疫层析法，两种检测方法均具有操作简单、快速、抗基质干扰强、准确性高等优点。秦伟涛[3]研究发现，采用胶体金免疫层析法检测人血清中EB病毒衣壳抗原IgA抗体，稳定性好，特异性、敏感性极高，均超过90%。唐嘉等[4]研究发现，采用胶体金免疫层析法定性试纸条测定人体粪便中血红蛋白，有助于提升人体粪便潜血检出率，便于消化系统疾病的早期诊断，敏感性高。

4.2 半定量及定量检测 胶体金本身就具有颜色，且根据制备出胶体金颗粒大小呈现出的颜色也各有差异。临床采用光学传感器或肉眼，可根据颜色的深浅变化进行半定量、定量分析。

4.2.1 半定量检测 半定量检测是介于定性与定量之间的检测，主要是根据电泳图估计参照亮度一致前提下确定目标基因的表达，检测速度较快，多应用于农药残留、血药浓度测定等不太追求成分准确含量的检测中。任刘丽等[5]研究发现，基于胶体金免疫竞争法的原理制备拉莫三嗪单克隆抗体，以胶体金进行抗体标记，可实现对拉莫三嗪血药浓度的半定量快速检测，且效率高、成本低，广泛适用于基层医疗机构。宋兴兴等[6]研究结果显示，采用葛根素胶体金试纸，以半定量限为34µg/ml评价葛根药材质量，检测速度快、准确性高，说明免疫胶体金技术在原料中药采购快速检验中具有较高的应用价值。

4.2.2 定量检测 定量检测是测定物质中相关组分含量，在各种病理诊断中具有较高的应用价值。随着免疫胶体金检测技术的不断发展、完善，胶体金免疫定量检测仪的出现实现建立一种新型快速定量检测方法。免疫胶体金快速定量检测主要是基于硝酸纤维素膜上检测线颜色深浅变化与检测物浓度呈一定关系，可将光学传感器扫描结果与标准曲线相对比，进而得到定量分析结果。胶体金定量检测试纸条显色属于动态变化过程，试纸工艺、待测样本差异性及检测时环境均可对显色结果造成影响，需做好质量控制。同时采用检测线/标准曲线比值进行定量分析也可在一定程度上控制温度、样本等对显色的影响。张兰兰等[7]研究发现，根据抗人妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)单抗细胞株筛选配对抗体后，建立免疫胶体金快速定量检测方法，与人甲胎蛋白、人胎盘催乳素、人泌乳素、人绒毛膜促性腺激素等不存在交叉，为产前诊断提高诊断率。免疫胶体金技术定量检验在新冠肺炎快速检测中也发挥较良好效果。宁乐平等[8]以核酸检测结果为标准进行研究，发现两种胶体金免疫层析技术试剂在新型冠状病毒定量检测诊断中的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值均超过95%，可作为核酸检测的重要补充。免疫胶体金技术定量检测不仅可用病理、生理指标测定，还可用于药物成分、毒药残留量等测定中。李耀磊等[9]研究发现，胶体金免疫层析技术在中药材中对黄曲霉毒素B1定量检测性能较好，在中药材质量、毒性评价中具有较高的应用价值。

4.3 多项联合检测 多项联合检测技术在同时进行多种成分检测，能够节省成本、时间，是未来临床检验的发展方向。黎明等[10]研究结果显示，采用免疫胶体金法、酶联免疫吸附法、生物酶联免疫吸附试验联合检测，在早期糖尿病肾病诊断中的准确性较单一检测更高。岳晓红等[11]研究发现，胶体金法、实时荧光核酸恒温扩增检测技术、酶联免疫法在儿童肺炎支原体感染检测诊断中具有较高的诊断价值，各种方法之间是一种互相补充关系，联合诊断准确性更高。

5 小结

免疫胶体金技术作为一种新型的免疫标记技术，较免疫荧光技术、免疫酶标技术、放射免疫技术更加快捷、方便，适用于基层医疗机构或现场检测，免疫胶体金技术定量分析仪则提升该技术临床诊断的准确性。但免疫胶体金技术较其他检测方法灵敏度、阳性检出率等存在一定差异。同时胶体金免疫定量检测仪则会受到检测环境、待检物质差异性等的干扰，存在明显局限性。但随着免疫胶体金技术持续发展，临床可根据该技术的应用现状持续完善胶体金制备体系，建立更加科学的评估标准，研发更高效、高质量的免疫胶体金技术定量分析仪，应用前景较好。