基于MiSeq高通量测序技术奶疙瘩细菌群落结构研究

倪慧，葛东颖，杨甜甜，单春会，佘雅倩，肖石高，郭壮

（1.湖北文理学院 湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北 襄阳441053；2.石河子大学 食品学院，新疆 石河子832003；3.湖北澳利龙食品股份有限公司，湖北 宜昌443000）

0 引言

作为我国传统酸凝奶酪的一种，奶疙瘩是哈萨克族和蒙古族等少数民族传统特色奶制品，具有咸酸的口感并保留了大量牛奶中的天然营养成分[1]。奶疙瘩可分为干湿两类，将酸奶用纱布挤掉乳清即为湿奶疙瘩，而将湿奶疙瘩风干后即为干奶疙瘩。作为自然发酵奶制品，奶疙瘩中微生物类群的丰度和多样性均较高，且以乳酸菌为主[2]。Illumina MiSeq高通量测序技术具有测序深度广、测试样本量大和准确性高的优点[3]，广泛用于酸奶[4]、奶酪[5]和原料乳[6]等乳制品微生物多样性的解析中。

作为万顷荒漠中的绿洲，新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州具有塞外江南的美誉，盛产奶疙瘩和酸马奶等多种发酵乳制品，独特的环境可能赋予了其发酵乳制品独特的微生物群系。本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术，对采自伊犁地区的干奶疙瘩样品，进行基于细菌16S rRNA基因V3-V4可变区的测序，并对细菌类群的基因功能进行了注释，以期为后续新疆地区奶疙瘩的工业化生产和传统发酵乳制品的微生物解析提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

干奶疙瘩，新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州。

DNeasy mericon Food Kit提取试剂盒，德国QIAGEN公司；引物338F/806R，武汉天一辉远生物科技有限公司；DNA聚合酶、dNTPs mix和PCR缓冲液，宝生物工程大连有限公司；Illumina MiSeq测序配套试剂，美国Illumina公司。

1.1.2 设备

MiSeq PE250高通量测序平台，美国Illumina公司；R920机架式服务器，美国DELL公司；5810R台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Veriti FAST梯度PCR仪，美 国ABI公 司；UVPCDS8000UVPGDS8000凝胶成像分析系统，英国UVP公司；164-5050基础电泳仪，美国Bio-Rad公司。

1.2 样品采集

于2019年8月的10-13日，8个干奶疙瘩样品采自新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州（E 80°9'42''～91°01'45''，N 40°14'16''～49°10'45''）牧区，编号为YL1-YL8。样品采集时候使用手术剪将其按照约10 mm×5 mm×5 mm（长×宽×高）的大小剪碎，放于灭菌的50 mL离心管中备用。

1.3 DNA提取、PCR扩增和高通量测序

使用QIAGEN DNeasymericon Food Kit试剂盒进行微生物DNA提取，并参照王玉荣[7]的方法进行16S rRNA V3-V4区的PCR扩增，扩增产物寄往上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。

1.4 生物信息学分析

使用QIIME分析平台[8]，将质检合格的序列依次使用PyNAST对齐[9]、UCLUST划分得到各分类操作单 元（operational taxonomic units，OTU）[10]、ChimeraSlayer检查去除含有嵌合体的OTU[11]、序列比对明确分类学地位[12]、在构建系统发育树的基础上进行β和α多样性计算、最后参照蛋白质直系同源簇数据库（clusters of orthologous groups of proteins，COGs）使用PICRUSt软件注释细菌的基因功能[13]。

本研究将在8个奶疙瘩样品中均存在且平均相对含量大于1.0%的细菌门和属定义为优势细菌门和属；将在所有样品中均存在的OTU定义为核心OTU；若某个OTU在聚类I的样品中均存在，而在另一聚类样品中均不存在，则将其定义为聚类I的特有OTU，反之亦然[14]。

1.5 图形绘制与数据分析

基于UniFrac距离使用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚类进行β多样性分析，使用Moon-Median检验进行不同聚类间各指标的差异性分析。使用R软件（v3.6.2）的waterfall和pheatmap软件包绘制气泡图和基因功能热图，使用Origin2017绘制其他图。

2 结果与分析

2.1 细菌群落结构β和α多样性研究

纳入本研究的8个奶疙瘩样品共产生230 905条高质量的16S rRNA序列，平均每个样品28 863条，UCULST划分得到43 299条代表性序列和4 495个OTU，最后剔除67个嵌合体后尚存4 228个OTU。基于UniFrac非加权与加权的UPGMA聚类分析，结果如图1所示。

图1 基于UniFrac非加权（a）与加权（b）的UPGMA聚类分析

由图1可知，在基于UniFrac非加权聚类分析中样品形成了明显的聚类趋势，其中样品YL1、YL4、YL5和YL6形成聚类I，样品YL2、YL3、YL7和YL8形成聚类II，而这种聚类趋势在加权聚类分析中并不明显。导致这种现象发生的原因在于，不同奶疙瘩样品中优势菌属可能无明显不同，但在OTU水平上或在若干相对含量较低的细菌类群上存在一定差异。本研究对测序深度与发现物种数和香农指数的变化趋势进行了分析，结果如图2所示。

图2 发现物种数（a）和香农指数（b）曲线

由图2可知，即使测序量最多的样品YL8（31 489条），其发现物种数曲线仍呈上升趋势，而测序量最少（25 571条）的样品YL3，其香农曲线在测序深度约为3 000条时即进入了平台期。由此可见，本研究的测序深度已可完全捕获奶疙瘩样品中细菌的多样性，测序数据可满足后续分析的要求。由图2亦可知，经Moon-Median检验发现，聚类I样品的丰度要非常显著高于聚类II（P＜0.01），但香农指数间差异不显著（P＞0.05）。

2.2 基于门、属和OTU水平上细菌群落组成分析

经序列比对发现，奶疙瘩样品中共存在5个细菌门和28个细菌属，在门和属水平上优势菌含量如图3所示。

图3 优势细菌门（a）和属（b）相对含量的气泡图

由图3可知，Firmicutes（硬壁菌门）是奶疙瘩样品中的优势细菌门，相对含量高达99.26%，Lactobacillus（乳酸杆菌属）和Streptococcus（链球菌属）是优势细菌属，相对含量分别是87.59%和9.48%。本研究亦发现Lactococcus（乳球菌属）虽不是优势菌，但其在各样品中的平均相对含量为0.33%。上述3类菌属均属于乳酸菌，由此可见，乳酸菌为奶疙瘩中的优势细菌，累计相对含量高达97.4%。同样采用Illumina MiSeq高通量测序技术，王春艳对伊犁牧区传统手工奶酪（即奶疙瘩）细菌多样性进行了研究，结果发现Lactobacillus（乳酸杆菌属）的相对含量仅为9.17%，样品中的优势细菌还包括Ralstonia（雷尔氏菌属，30.41%）、Staphylococcus（葡萄球菌属，6.32%）和Acinetobacter（不动杆菌属，4.62%）等[15]。通过Moon-Median检验发现，聚类I与聚类II样品在优势门和属上均无明显差异（P＞0.05）。

本研究共划分了4 228个OTU，但仅有18个OTU存在于所有样品中，包含了196 613条序列，占总序列数的85.15%。由此可见，8个奶疙瘩样品中共有大量的核心细菌类群。核心OTU中有6个鉴定为Lactobacillus（乳酸杆菌属）、5个鉴定为Streptococcus（链球菌属）、2个鉴定为Acetobacter（醋杆菌属），但有5个无法鉴定到属水平，只能确定其隶属于乳杆菌目（Lactobacillales）。不同核心OTU的平均相对含量亦存在较大的差异，如OTU3705（隶属于乳酸杆菌属）所包含序列数占总序列数的56.60%，而OTU3565（隶属于醋杆菌属）所包含序列数仅占总序列数的0.02%。本研究选取包含序列数平均相对含量大于1.0%的OTU构建了柱状图，结果如图4所示。

图4 包含序列数相对含量大于1.0%核心OTU的柱形图

由图4可知，有3个核心OTU所包含序列数平均相对含量大于1.0%，分别为OTU3705、OTU4026和OTU1780，含量分别为56.60%、18.76%和7.56%，其中OTU1780被鉴定为Streptococcus（链球菌属），而其他2个OTU被鉴定为Lactobacillus（乳酸杆菌属）。上述结果进一步证实了8个奶疙瘩样品中共有大量的核心细菌类群，3个核心OTU的累计平均相对含量即高达82.92%，且乳酸菌为奶疙瘩中的优势细菌。OTU4026在聚类I样品中累计平均相对含量仅占0.75%，而在聚类II样品中为36.77%，经Moon-Median检验发现两者差异非常显著（P＜0.01），而其余2个OTU在不同聚类样品间的差异均不显著（P＞0.05），这也进一步证实了在OTU水平上存在一定差异可能是导致8个奶疙瘩样品划分为2类的原因之一。

导致8个奶疙瘩样品划分为2类的原因还可能与在若干相对含量较低的细菌类群上存在一定差异有关。聚类I和聚类II中特有OTU的平均相对含量如表1所示。

表1 聚类I和聚类II中特有OTU的平均相对含量

由表1可知，聚类I样品中含有37个特有OTU，其中34个鉴定为Lactobacillus（乳酸杆菌属），平均相对含量为4.756%，各有1个特有OTU鉴定为Acetobacter（醋杆菌属）、Streptococcus（链球菌属）和Salmonella（沙门氏菌属），但其平均含量仅为0.266%、0.084%和0.051%。由表1亦可知，聚类II样品中含有2个特有OTU，分别被鉴定为Lactobacillus（乳酸杆菌属）和Streptococcus（链球菌属），平均相对含量仅为0.047%和0.030%。由此可见，虽然不同聚类样品间存在部分独特的细菌类群，但其含量相对较少。

2.3 奶疙瘩样品的PICRUSt基因功能预测

结果见图5。

图5 基因功能预测热图

由图5可知，所有序列共预测到3 728个COG，分别隶属于23个功能大类，其中碳水化合物及氨基酸运输和代谢的功能相对高表达。中、短碳链的脂肪酸、酯类和醛类化合物为新疆地区奶疙瘩中主要的挥发性化合物[16]，其中酸类化合物与氨基酸分解有关，会赋予奶制品特有的乳臭风味[17]；发酵过程中氨基酸代谢产生的伯醇和仲醇可以与短链脂肪酸或中长链脂肪酸发生酯化反应，产生大量的酯类化合物[18]；而醛类化合物的生成亦与氨基酸的转氨作用有关[19]。由此可见，氨基酸代谢与奶疙瘩挥发性风味物质的形成具有较大影响，这也可能是奶疙瘩样品中细菌氨基酸运输相关功能基因高表达的原因。经Moon-Median检验发现，聚类I和聚类II样品间细菌各功能基因的表达差异均不显著（P＞0.05）。

3 结论

本研究使用Illumina MiSeq高通量测序技术，对采自伊犁地区的干奶疙瘩样品微生物多样性进行了解析，发现虽然不同奶疙瘩样品在若干相对含量较低的细菌类群上存在一定差异，但Lactobacillus（乳酸杆菌属）和Streptococcus（链球菌属）是各样品中的优势菌属。不同奶疙瘩样品存在大量的共有细菌类群，该类群亦属于Lactobacillus（乳酸杆菌属）和Streptococcus（链球菌属），且具有较强的碳水化合物及氨基酸运输和代谢的功能。通过本研究的实施可为后续新疆地区奶疙瘩工业化生产和传统发酵乳制品的微生物解析提供一定的数据支持。