不同温度对桑叶菜1-脱氧野尻霉素含量的影响

李 娜 范 伟 贾漫丽 王彬彬 陈秀灵 杨贵明 李季生

(河北省高校特产蚕桑应用技术研发中心，承德医学院蚕业研究所，河北承德 067000)

蚕桑是我国的传统农业，在国民经济中占有重要的地位。近几年来，随着蚕桑资源多元化利用的开展，桑树的饲用、食用和生态价值凸显，药用价值更是备受关注[1-2]。研究表明，桑叶中含有的1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)可以抑制α-葡萄糖苷酶、葡萄糖淀粉酶的活性，具有抗病毒、减肥和增加胰岛素敏感性等多种重要生理功能[3]。所以，开发适宜于大众食用的桑叶产品尤为重要。桑叶菜是近年来研究较多的食品之一，鲜嫩的桑叶菜不仅颜色嫩绿，口感也深得消费者喜欢。用桑叶菜制作的凉拌菜、饺子馅等菜品营养价值高，还具有降血糖的独特作用。如果在此基础上，通过预处理改变桑叶菜的贮藏和加工温度来间接的提高其降糖成分的含量，将对更加有效地利用桑叶极为关键。Yu X等[4]为了确定霜冻对桑叶化学变化影响的分子机制，研究了桑叶(Morus alba L.)中类黄酮糖基转移酶(UFGT)活性、表达水平和黄酮苷的积累三者之间及其与温度之间的关系，结果发现，不仅平均温度的高低与UFGT基因表达水平和UFGT活性呈显著负相关，而且霜冻后的低温可以诱导桑叶中UFGT基因的表达，从而导致黄酮苷的积累。季节性温度变化对不同生长季节的DNJ含量有显著影响[5]， 4月至5月间低温下DNJ含量较低，而7月至8月夏季DNJ含量最高，9月后DNJ含量随温度逐渐下降。张魏琬麒等[6]研究发现，桑叶经霜前后发生变化的主要是环境温度，平均气侯温度与次生代谢产物含量间的相关性分析显示，气温与黄酮类4个成分总和含量呈极显著负相关，与DNJ含量呈极显著正相关。一些相关研究也表明，温度是影响生物碱含量的重要因素，温度升高可促进生物碱的积累[7-8]。以上的研究主要是针对正在生长中的桑树进行分析得出的结论，那么温度对离体桑叶是否也具有类似的作用？秦樱瑞等[9]通过对热风干燥、微波干燥、冷冻干燥和真空干燥4种干燥方式的比较及综合分析发现，温度为75 ℃，时间为60 min的热风干燥后可得色泽较好的桑叶粉，其中含水量为(4.87±0.21)%，DNJ、总黄酮、多糖的含量分别为(227.47±5.79) mg/100 g、(49.51±1.18) mg/g和(11.29±0.01)%，普遍高于其他3种处理方法，同时热风干燥后桑叶品质也较好，均呈现嫩绿色；通过测定桑叶粉对α-葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用发现，干燥后桑叶粉并未失去降糖作用。这可能暗示了温度对离体桑叶DNJ含量有一定的影响。鉴于此，本研究以3个适宜菜用的桑树品种嫩梢为材料，通过改变不同贮藏和干燥温度来研究其对离体桑叶DNJ含量的影响，采用高效液相色谱法测定DNJ的含量，为桑叶菜的采收、储藏和干燥工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 桑叶样品采集、处理

试验中用到的桑叶均采摘自承德医学院蚕业研究所蚕桑科技园内，样品采摘时间为2018年8月21日至23日上午8时，采摘部位为一芽四叶的嫩梢，桑树品种为桑叶菜候选品种选792、桂花桑和冀桑2号。每个品种随机采摘嫩梢，立即带回实验室，根据实验设计进行随机分组，每个处理随机分配，各重复3次以确保实验的准确性。

1.1.2 主要试剂

1-DNJ标准品(含量≥98%)、9-芴甲氧羰酰氯(9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC-Cl)；色谱纯乙腈、甲醇购自上海阿拉丁试剂；甘氨酸、醋酸、浓盐酸等其他试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

配备SPD-20AV紫外检测器的高效液相色谱系统LC-2030(日本岛津)； 万分之一分析天平(OHAUS AR224CN，奥豪斯仪器有限公司)，超纯水系统(Micro Pure UV/UF，Thermo)，超声波清洗仪(KS-300EⅡ型，宁波海曙科生超声设备有限公司)，台式冷冻高速离心机(VELOCITY 18R，Dynamica)等。

1.3 方法

1.3.1 样品分组

1)一天内桑叶菜DNJ含量随温度变化情况。桑树品种选择冀桑2号，采摘时间2018年8月23日，天气晴，当天最高气温29 ℃，最低气温16 ℃。从早晨6点准时取样至当天18时结束，每隔2 h采样1次，每次3个重复。每次采摘后立即放入超低温冰箱(-80 ℃)冷冻保存，以维持叶内活性成分的相对稳定，之后统一进行真空冷冻干燥，60目粉碎。

2)桑叶菜在不同干燥温度下DNJ含量的差异。桑树品种选择冀桑2号和桂花桑，采摘时间2018年8月21日上午8时，干燥方式分为真空冷冻干燥(鲜样)、25 ℃烘干和40 ℃烘干，处理完毕后一起进行60目粉碎。

3)桑叶菜不同温度储藏一天后DNJ含量变化。桑树品种选择桂花桑和冀桑2号，采摘时间2018年8月22日上午8时，桑叶菜随机采摘后分别放置在-80 ℃，-20 ℃，4 ℃三个温度条件下，取出后立即冷冻干燥，过60目筛。

4)桑叶菜变温处理后DNJ含量差异。桑树品种选择选792，冀桑2号和桂花桑，采摘时间2018年8月23日上午8时，桑叶菜随机采摘后先于4 ℃冰箱存放1 d，取出后立即在室温条件下(25 ℃)放置0 d、1 d、3 d、5 d，然后分别收集至-80 ℃冰箱保存，冷冻干燥后粉碎，60目过筛，对照为鲜样(真空冷冻干燥)。

1.3.2 DNJ提取

采用盐酸提取法，首先准确称量干至恒重的桑叶粉0.25 g，于50 mL离心管中加入25 mL 0.05mol/L盐酸，涡旋震荡混匀2 min后，超声提取30 min，12 000 r/min高速离心30 min，取上清液于另一新50 mL离心管中，上述残渣继续加入0.05 mol/L盐酸重复提取一次，将两次的提取液合并，0.05 mol/L HCl定容至50 mL，分析待用。

1.3.3 衍生化过程

吸取200 μL待测样品提取液至1.5 mL离心管后，向其中加入338 μL 0.4 mol/L硼酸钾缓冲液(pH8.5)，再加入250 μL浓度5 mmol/L的FMOC-Cl/乙腈衍生化试剂，在加入250 μL超纯水之后，充分振荡混匀，室温下静置反应20 min。然后加入1 mol/L甘氨酸(Gly)200 μL来中和反应中剩余的FMOC-Cl使反应终止，最后加入1%(V/V)醋酸溶液132 μL，以生成稳定的DNJ-FMOC。混匀后用注射式0.22 μm尼龙膜滤器过滤，收集滤液待上机分析。

1.3.4 色谱条件

高效液相分析采用RP-HPLC紫外检测法，色谱柱为Kromasail-C18分析柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)及ODS3预柱(5 μm，4.6 mm×10 mm)，检测波长为254 nm。室温25 ℃，柱温25 ℃，以乙腈-0.1%醋酸55∶45(V/V)比例的混合相作为流动相，流速设置为1.0 mL/min，进样体积为20 μL/样本，结束分析时间为60 min/样本。对每个待测样本采用3次上机重复测定。

1.3.5 标准曲线测定

依次配置1 μg/mL，10 μg/mL，20 μg/mL，30 μg/mL，40 μg/mL，50 μg/mL，60 μg/mL不同浓度的DNJ标准品溶液，按照1.3.3所使用的流动相等色谱条件，分析标准样品，最后以标准品溶液X不同浓度为自变量对因变量峰面积Y值做标准曲线并进行线性回归分析，得出样品提取液DNJ浓度计算公式。

1.3.6 DNJ含量计算

使用Lab solutions色谱处理工作站分析软件，分析计算提取液中DNJ?的含量采用外标法。对每个待测样本的3次重复测定DNJ吸收面积，按照DNJ标准品得出的标准曲线的计算公式，计算桑叶中DNJ含量的结果，取每个样本3次重复的平均值，分析标准方差并对不同处理之间进行显著性分析。

桑叶中DNJ含量计算公式为：含量(mg/g)=提取液DNJ浓度(μg/mL)×提取液体积(mL)/样品质量(g)/1000

1.3.7 数据处理

运用SPSS18.0软件对数据进行t 检验，作图软件为Origin 8.0。

2 结果与分析

2.1 色谱检测与标准曲线

从图1(A、B、C)可以看出，DNJ在1.3.4所述的色谱条件下分离良好，和其他组分能够更好分离，从而保证了测试的准确性。对1.3.5中制备的DNJ标准品进行上机分析，得到与不同浓度DNJ标准溶液相对应的色谱峰面积值，以标准品溶液X不同浓度为自变量对因变量峰面积Y值进行线性回归分析。结果发现，在标准溶液质量浓度为1～60 μg/mL范围内，分析结果显示出良好的线性关系(y = 13524x + 7391.3，且相关系数R2= 0.9998)，符合线性回归标准(图1D)。

2.1.2 12 h内桑叶菜DNJ含量随气温的变化情况

在前人的研究中，桑叶随季节的变化呈现出一定的规律，这对了解桑叶菜中DNJ的季节性变化规律有很大帮助，同时对生产也有很好的指导意义。但在桑叶菜的实际生产中，除了要关注季节性变化，也必须要研究桑叶菜在一天内的适宜采摘时间，也就是要关注桑叶菜DNJ含量随一天内气温的变化规律。从图2可以看出，随着气温的不断升高，DNJ含量呈现先升高后下降的变化趋势。在上午8时到下午2时这7 h内，DNJ含量均达到极显著水平，说明桑叶菜的采摘适合在这一时间段进行。同时，由于是12 h内的样品，桑叶菜DNJ含量随气温的变化也暗示了温度与DNJ含量存在某种关联。

2.1.3 不同温度干燥对桑叶菜DNJ含量的影响

在正常生长的桑叶菜中，DNJ含量随气温的升高呈现出升高的趋势。在桑叶菜采摘后能否利用DNJ随温度变化这一特点来提高其含量有待进一步研究。图3所示，将桂花桑和冀桑2号桑叶菜采摘后分别立即采用真空冷冻干燥(-60 ℃)、25 ℃常温烘干和40 ℃低温干燥3种方式来处理桑叶菜。结果发现，随着干燥温度的上升，DNJ含量呈现出显著或极显著的上升趋势。研究结果说明温度对离体的桑叶菜中DNJ含量同样具有类似的作用。

2.1.4 不同贮藏温度对桑叶菜DNJ含量的影响

为进一步验证温度对桑叶菜DNJ含量的影响，分别采摘桂花桑和冀桑2号桑叶菜进行不同温度贮藏实验。结果如图4所示，将桑叶菜分别放置到-80 ℃、-20 ℃和4 ℃三个温度梯度的冰箱中，放置一天后立即真空冷冻干燥并进行测试。随着贮藏温度的升高，两个品种桑树呈现出类似的变化趋势，DNJ含量均随着温度的升高显著或极显著上升。这个结果进一步验证了温度与DNJ含量的关系。

2.1.5 变温处理和存放时间对桑叶菜DNJ含量的影响

从2.1.4中可以发现，选择4 ℃进行贮藏可以显著或极显著的增加DNJ含量，这对于桑叶菜干燥过程中的存放温度有一定的指导意义。在4 ℃条件下，桑叶菜既能保持鲜绿的品质，还有助于提高DNJ的含量。在此条件下，将桑叶菜再次放置到25 ℃室温中是否还能进一步提高DNJ的产量也值得研究。因为在桑叶菜的销售过程中，将桑叶菜始终保持在冰箱中势必会增加成本，而通过冷链运输后摆在货架上进行销售也有一定的鲜活时限，那么在三至五天的销售过程中DNJ含量是否会保持恒定就极为关键。为此，采摘选792、桂花桑和冀桑2号3个桑树品种进行变温实验。桑叶菜采摘后放置在4 ℃冰箱中1 d后取出，模拟货架摆放在25 ℃环境中1～5 d，然后进行真空冷冻干燥和色谱分析。以-80 ℃样品为对照，结果发现(图5)，3个桑树品种桑叶菜DNJ含量在贮藏取出后基本保持恒定，选792和冀桑2号均有显著或极显著的增加趋势。说明常温存放桑叶菜不会降低有效成分DNJ的含量。

3 讨 论

桑叶菜是近年来新兴的叶菜类食品，由于具有很好的降糖效用，已经成为部分消费者青睐的菜品之一。本研究以桑叶菜降糖成分DNJ为指标，探讨了桑叶菜的采收、贮藏和干燥因素对DNJ含量的影响，为合理的开发利用桑叶菜食品提供了一定的理论支持。研究发现，温度的提高能够有效增加桑叶菜中DNJ的含量。无论是正常生长中的叶片，还是采摘后离体的桑芽，亦或是不同的干燥温度下的芽菜，都能很好地说明这一结论。杨兵等[10]研究了不同生长季节桑叶中1-脱氧野尻霉素、芦丁及多糖含量的动态，结果发现，DNJ含量在7、8月份含量最高，说明了夏季的高温有利于桑叶DNJ的合成。朱旭东等[11]研究了不同地域和季节蚕沙中DNJ含量的差异，从家蚕富集DNJ的角度间接的表明了温度升高对DNJ含量增加的积极影响。

温度等外界因子对植物次生代谢产物的积累有一定的影响，而这种影响对植物本身来说可能是一种天然的应激或保护[12]。初步掌握影响植物次生代谢产物积累的规律，对人们更加合理的开发利用植物资源具有一定的指导意义。和草本植物相比，木本植物次生代谢过程更加复杂，代谢产物多样，研究也相对困难[13]。植物次生代谢途径的多样性决定了其生物合成网络的复杂性，许多植物次生代谢途径仍然不清楚。但随着近几年基因组、功能基因组理论和技术的快速发展，运用蛋白质组学和转录组学[14]、代谢组学和基因组学[15]、代谢组学和转录组学[16]，以及蛋白质组学和代谢组学[17]等相结合的方法，使一些植物的次生代谢途径取得了重要进展，部分次生代谢过程的信号传导过程相继被阐明[18]。Dujun Wang等[19]人构建了具有同DNJ含量的桑叶样品的两个cDNA文库，通过转录组技术鉴定出38个独特的候选基因可能参与DNJ生物碱生物合成，发现5种CYP450转录物和两种甲基转移酶转录物与DNJ含量显著相关，为进一步研究桑树DNJ生物碱的生物合成途径提供了数据支撑。

在本研究中，DNJ含量变化究竟是由于基因的变化还是其他原因还很难判断。这是因为，桑叶在采摘后细胞并未凋亡，体内的生命活动不会终止。而由于温度的升高，桑叶叶片内部的物质成分会发生一系列的转化。如果这种转化造成了桑叶重量的减少，那么相对而言DNJ的含量势必会升高。虽然试验中将桑叶菜放置到-80 ℃和-20 ℃两个条件下进行比较，发现DNJ含量依旧在变化，也很难说明-20 ℃的温度就能抑制桑叶的生命活动。鉴于此，还应该更进一步的研究不同温度下桑叶重量的损耗，才能排除这种因素的影响。

4 结 论

4.1 天气温度的升高有利于桑芽菜DNJ含量的升高，上午8时至下午2时期间DNJ含量达到较高水平。

4.2 结合不同温度对桑叶DNJ含量的影响以及所产生的能耗等因素，桑叶菜4 ℃贮藏以及低温干燥均可以提高DNJ含量。