慢性乙型病毒性肝炎中医证候蛋白质组学研究进展＊

邓晓靖，雷亚云，曹贵霞，冯培民，2＊＊

(1.成都中医药大学临床医学院 成都 610075；2.成都中医药大学附属医院 成都 610075)

慢性乙型病毒性肝炎，又称慢性乙型肝炎(CHB，以下简称“慢乙肝”)，是因感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)而导致的肝脏慢性疾病，是一种严重影响人类健康的传染性常见病。据世界卫生组织(WHO)统计全世界有超过2.57亿人被感染，每年因HBV感染造成的死亡超过88.7万人，大约40%的肝癌病例由慢乙肝发展而来，其死亡率在癌症中居第2位[1]。尽管我国乙肝疫苗在预防乙肝中取得了不错的成绩，但2014年WHO发布的白皮书中提到在中国一般人群中乙肝病毒表面抗原流行率约为5.49%，仍有超过7400万例HBV携带者[2]。目前核苷(酸)类似物和干扰素是抗病毒治疗中的有效方案，但仍不能彻底治愈乙肝、不能彻底消除炎症、不能逆转所有肝硬化、不能完全阻断肝脏癌变进程[3]。中医药治疗慢乙肝在临床中有丰富的病例报道，并有诸多成功案例，但由于医学指征、症候的不同，也存在较大的辨证差异，疗效不确定等不足。

蛋白质组学(proteomics)是研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。蛋白质组是指一种基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组的研究为众多疾病机理的阐释提供理论依据，并且亦为疾病的治疗提供了可量化可衡量指标，是人类认识生命活动规律的重要手段。由于在疾病的不同阶段，不同分型的蛋白质表达情况不尽相同，因此可以说蛋白质组是一个在空间和时间上不断动态变化着的整体，这与中医学“整体观念”的认识相契合[4]。通过比较正常个体与病理个体之间的蛋白质组差异，可以找到疾病发生、发展过程中的特异性蛋白质分子，这为疾病的早期诊断提供了有效的分子标志，亦可成为新药设计的分子靶点，因此近年来，在人类疾病发病机制、治疗和药物筛选研究中蛋白质组学被广泛运用，并取得了大量有意义的结果[5-7]。

有研究表明，中医“证”的本质是基因型及其表达，疾病的症状体征变化是基因及其在mRNA、蛋白质水平差异的外在表现[8]。慢乙肝中医证候蛋白质组学是研究慢乙肝不同证型间差异蛋白质的有效方法，找到不同证型所对应的病理状态下人体血清蛋白质组，组建不同证型蛋白质组学信息库，从整体层面寻找慢乙肝的证侯分子标签，是病证结合的中西医结合现代化研究的新模式[9]，也是中医学走“精准”技术层面的升级，应用蛋白质组学能够全面系统地分析慢乙肝不同证型相关蛋白谱的特征及其差异，有助于进一步提高中医证候诊断的客观性，揭示中医证候本质，为临床应用提供重要的技术指导。本文将对慢乙肝中医证型的蛋白组学研究现状进行综述，介绍目前蛋白质组学在中医证候研究中的主要技术手段和研究方法，并对不同证型的慢乙肝蛋白组学研究现状进行归纳总结，以期为当前慢乙肝中医证候客观化研究提供一定的理论和实验依据。

1 蛋白质组学研究技术

蛋白质组学从本质上讲是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，因此其处理的数据是海量的，这就要求所采用的技术具有高通量、快速、准确、高效等特性，可以说蛋白质组学研究能否成功，在较大程度上取决于所采用的技术手段和研究方法水平的高低。近年来，物理和化学领域的技术进步为蛋白质组学的发展提供了强有力的手段，当前蛋白质组学的发展所采用的主要研究技术包括：

1.1 双向凝胶电泳

双向凝胶电泳是根据蛋白质的生理化学特性(等电点和分子量)进行蛋白质分离的一种方法，是蛋白质组学中最有用的复杂生物混合物蛋白质分离方法之一。首先，它根据蛋白质等电点的不同实现第一维等电聚焦分离，然后，在第二维中使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术根据分子量的不同将变性的蛋白质进行分离，从而在二维平面上将复杂蛋白混合物中的各个蛋白质片段分开。分离后的蛋白质可用于蛋白质转录及转录后修饰、蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用、致病机制及耐药机制的研究等诸多方面，因此双向凝胶电泳技术对蛋白质组学的研究具有十分重要的意义。目前所发展的双向电泳技术具有对蛋白质检验比较灵敏、高分辨率的完整分离蛋白质等特点[10]，但同时也存在着对低丰度蛋白不敏感、极端相对分子质量蛋白漏检、样品处理复杂以及难以自动化等缺点[11]。

1.2 生物质谱技术

生物质谱技术是一种仪器分析技术，广泛应用于生物和临床样品的分析，其基本原理是复杂混合物样品在线分离后经离子化送入质谱仪，并被裂解为不同质量的碎片，通过辨别其质荷比(m/z)来确定样品组分的分子量，从而推断出蛋白质的组成。其目前已经发展成为蛋白质组学研究的重要工具，用于了解蛋白质组的结构和行为[12]。常用的质谱主要包括两种：基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)。而生物质谱一般与液相色谱联合使用(LC-MS)。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDITOF-MS)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，激光能量被基质分子吸收，样品解吸附，基质与样品之间发生电荷转移从而使样品分子电离，离子化后的样品在质谱飞行管中飞行从而被测定分子量。MALDI-TOF-MS一般用于小肽和多肽质量指纹图谱的分析，是目前蛋白质组学检测中最为常用的一种鉴定方法[13]，该技术具有检测操作程序简单、灵敏度较高、分析时间较短、短时间内可达到高通量、且分析时产生的电荷准分子离子抗干扰能力较强等特点[14]。此外，基于质谱的分子组织学新兴技术基质辅助激光解吸电离质谱成像(MALDIMSI)的发展使可视化蛋白质组成为可能[15]。

电喷雾质谱(ESI-MS)是利用高压电场将质谱进样端毛细管柱流出液荷电，在氮气气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为众多荷电的子液滴，子液滴不断重复这一过程，从而使最终的液滴呈非常细小的喷雾状，此时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以荷电离子的形式进入质量分析器。分析过程无需其它的基质辅助，可以检测原子质量单位几千道尔顿的小分子乃至上百万道尔顿的大分子待测物，并且可以通过改变喷雾溶剂种类，显著提高不同种类待测物的萃取效率和选择性等，但是也存在分析时间较长等缺点[16]。

1.3 同位素相对标记与绝对定量(iTRAQ)技术

目前定量蛋白质组学的研究手段主要包括：细胞培养稳定同位素标记技术(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)、同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)、非标记定量蛋白组学技术(Label-free)等，其中iTRAQ技术在慢乙肝中医证候研究方面使用最为广泛。

iTRAQ技术是利用多种同位素试剂标记蛋白质N段或者蛋白质中赖氨酸侧链基团，然后通过高精度质谱仪进行分析测定蛋白表达量的方法。它一次可同时分析4-8个蛋白样本，通过蛋白质信息学手段分析获得差异蛋白的表达和定量。基于质谱分析的iTRAQ技术为蛋白质组学研究提供了样本来源广、高通量、高敏感性、高特异性、高重复性、操作相对简单的方法，是当今定量蛋白质组学研究的重要高通量筛选技术之一[17]。但也存在一些明显的缺点，如在样品前期处理阶段，样品酶解程度对结果的测定有非常大的影响，甚至会出现样品处理不当，结果偏差令人无法接受等问题；此外对于蛋白质的定量，iTRAQ主要依靠在二级质谱中离子峰面积比值计算，对其筛选差异蛋白也会产生一定影响。

1.4 蛋白质芯片及细胞因子抗体芯片技术

蛋白质芯片是一种检测蛋白质存在和变化的高效技术，它为蛋白质组学的研究提供了新的有力工具。其工作原理是：酶、抗原、抗体、细胞因子等探针蛋白分子与经化学处理的固体载体结合所得到的基质，处理血清、血浆等样品时，存在于这些样品中的某些蛋白就会与探针分子产生特异性结合，从而被探针分子捕获，经过洗涤、纯化后的结合蛋白可以采用质谱检测技术进行确认，这为研究疾病发展过程中蛋白质谱的变化规律提供了有力的技术支持。目前已有关于IMAC3、WCX2芯片和SELDI-TOF-MS技术检测分析和交叉验证慢性肝病患者的血清中特异蛋白，并根据蛋白的分子量和组织来源在蛋白数据库中检索、确定目标蛋白成为分子标志物的报道[18]。

细胞因子抗体芯片是近年来发展起来的一种高通量免疫检测分析方法，可以应用于同时检测微量样品中大量细胞因子表达水平的快速定性分析，可实现对相关细胞因子表达水平进行高通量、高特异性和系统重现性的检测，对不同样品之间细胞因子的相对表达丰度具有突出的表现[19]。细胞因子抗体芯片目前已经广泛应用于多种疾病生物标志物的筛选和鉴定[20-22]，在慢乙肝中医证候客观化研究方面已有报道[23]。

2 蛋白质组学研究与慢乙肝中医证候客观化

中医学认为慢乙肝是由湿热疫毒之邪内侵机体，正气不足无力抗邪时而发病，多因外感、情志、饮食、劳倦而诱发。2018年中华中医药学会肝胆病专业委员会制定了《慢性乙型肝炎中医诊疗指南》[24]，提出慢乙肝常见的中医证型分5种，分别为：肝胆湿热证、肝郁脾虚证、肝肾阴虚证、瘀血阻络证、脾肾阳虚证，其中，又以肝胆湿热证和肝郁脾虚证最为常见。近年来的研究表明：通过对慢乙肝不同证型进行蛋白组学分析，发现不同证型与正常组、证型与证型间都存在着不同的差异蛋白质，而这些蛋白质的表达在一定程度上也影响了不同慢乙肝患者的症状、体征等外在表现，充分证明了不同中医证候具有不同的客观化指标。

2.1 肝胆湿热证

戴幸平等[25]用MALDI-TOF-MS生物质谱技术对慢乙肝中医辨证为肝胆湿热证的患者和正常人进行了差异蛋白质鉴定分析，找到了46个差异蛋白质点，并初步鉴定了一些慢乙肝肝胆湿热证型差异表达的蛋白质。发现慢乙肝肝胆湿热证的病理过程中有可能发生单个核细胞的激活、细胞运动减弱以及可能影响细胞免疫功能；也有一定概率存在肝细胞抗损伤能力降低。随后对清肝利湿汤治疗慢乙肝肝胆湿热证外周血单个核细胞的蛋白质表达谱的差异进行了分析，结果发现细胞凋亡信号分子、凝血相关蛋白、细胞免疫及能量代谢相关酶可能是清热利湿汤治疗慢乙肝肝胆湿热证的作用靶点[26]。最近，席婷[27]对慢乙肝肝胆湿热型表达蛋白的研究中发现I-309(重组人趋化因子CCL1)、MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)、SDF-1(基质细胞衍生因子-1)、FAP(成纤维细胞激活蛋白)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子-1)、VCAM-1(血管细胞黏附分子-1)在慢乙肝肝胆湿热证表达水平升高，而ApoM(载脂蛋白M)呈低表达，提示慢乙肝肝胆湿热证中细胞免疫反应比较活跃且存在着炎症损伤，这与笔者相关课题组的研究结果相契合。笔者[28]对慢乙肝肝胆湿热证患者及健康对照组的血清采用蛋白质芯片技术、iTRAQ结合液相色谱和质谱串联的蛋白质组学定量分析发现：肝胆湿热证组与健康人组相比，IGF-1有显著性差异，表明肝胆湿热证组中细胞的增殖、分化和凋亡比较剧烈。

2.2 肝郁脾虚证

刘友平等[29]通过对比分析慢乙肝肝郁脾虚证及健康人的血浆蛋白质组表达谱，发现与正常对照相比较肝郁脾虚证存在8个明显的差异表达蛋白点，但遗憾的是未能对差异表达蛋白质的结构和功能做进一步更加深入的研究。陈文莉等[30]对慢乙肝肝郁脾虚证、湿热中阻证及健康男性的血清进行了差异蛋白质组学分析，经MALDI-TOF-MS分析鉴定出7个差异表达的蛋白质，在对这7个差异蛋白的生物学功能进行研究后，发现肝郁脾虚组中与肝功能、以及机体免疫水平相关的蛋白表达降低，且纤维化趋势更明显，同时检测出CRP和SAMP显著升高，从而表明肝郁脾虚患者存在明显的乙肝炎症活动。杨健坤等[31]应用iTRAQ技术对慢乙肝肝郁脾虚证、脾胃湿热证的血清差异蛋白表达谱进行了广泛筛查，在肝郁脾虚证组与正常对照组的比较中发现了30个差异表达蛋白，后续的差异蛋白生物学功能研究表明TU BAl A可能是慢乙肝肝郁脾虚证的潜在生物学标志物，可用于慢乙肝肝郁脾虚证分组；此外，还发现LGALS3BP(可溶性半乳糖凝集素3结合蛋白)在慢乙肝患者中存在差异表达，亦有可能成为肝郁脾虚证的良好标志物；而在肝郁脾虚证中上调的PON3(血清对氧磷酶3)可能对肝组织改变和导致肝病的肝细胞凋亡起保护作用[32]。

2.3 虚证(肝肾阴虚证、脾肾阳虚证)

王磊琼等[33]对中医虚证(肝肾阴虚证、脾肾阳虚证)慢乙肝患者和健康正常人血浆进行了差异蛋白质的分析鉴定，发现慢乙肝中医虚证中APO-A2、HP表达均明显下降，从而推测肝细胞的损害、脂代谢紊乱、肝细胞合成HP的能力下降、分解增加、机体的非特异性免疫力下降均与慢乙肝中医虚型证型的形成机制有关，进而认为慢乙肝中医二虚证(肝肾阴虚证、脾肾阳虚证)具有相同的蛋白质变化规律。刘友平等[34]采用双向电泳技术结合质谱分析对慢乙肝脾肾阳虚证患者及健康对照者的血浆蛋白质表达谱进行研究，共鉴定出7个差异蛋白，其中VN、载脂蛋白等反映肝脏分泌功能的蛋白质在脾肾阳虚证中呈较低水平，脾肾阳虚证组中急性时相蛋白SAMP较对照组下调，这充分说明慢乙肝脾肾阳虚证中肝脏组织不存在明显的炎症反应，而表现为明显的蛋白合成功能障碍。

2.4 脾胃湿热(湿热中阻证)

魏嵋等[35]对慢乙肝湿热中阻证患者及健康对照的血浆蛋白质，通过质谱分析鉴定获得7个蛋白点，认为慢乙肝湿热中阻证患者肝脏损害较轻微，亦无明显的炎症反应，以及差异表达蛋白Apo AⅠ、Apo AⅣ对慢性乙肝湿热中阻证的诊断、药物治疗及临床预后具有重要价值；然而陈文莉等[30]的研究则认为在湿热中阻证中急性时相蛋白以及和脂类代谢有关的蛋白质表达较高，临床表现出的湿热证候相关症状越明显，肝功能损害越重，所以对比正常组反应急性时相蛋白质如CRP(C反应蛋白)、SAMP(血清淀粉蛋白P)在湿热中阻组中表达升高较突出。杨健坤等[31]在脾胃湿热组筛选出24个差异表达蛋白，其中AcTA2、AcTG 2、zN F628、DEFAl、D EFA3、caM可能是慢乙肝脾胃湿热证的潜在生物学标志物；同时作者还发现了慢乙肝脾胃湿热证特异性差异表达的蛋白，如ITIH1(α-胰蛋白酶抑制剂重链H1)，THBS1(血小板反应蛋白-1)，C5(补体C5)和ALB(白蛋白)，其中ITIH1的低表达表明可用于区别慢乙肝脾胃湿热证和肝郁脾虚证。

慢乙肝是一种传染性疾病，中医学认为其是由于外来邪气入侵，正气不能鼓邪外出，正邪交争于内而发病，其病因应归于“疫毒、杂气”。一般而言，湿热证患者感邪较重，正气亦不亏，湿热毒邪内蕴肝胆、中焦，正邪抗争剧烈，属“实证”，上述蛋白质组学研究亦提示肝胆湿热证组机体内有较重的炎症反应以及较强的细胞免疫，脾胃湿热证组结果同肝胆湿热证相类似，表现为肝细胞损害较重，同时细胞修复及能量代谢调节活跃；肝郁脾虚证患者感邪后肝气失于疏泄，郁结而横逆犯脾，致脾气亏虚，正气不足，正邪交争不如湿热证，蛋白质组学结果则表明其炎症表现较轻，而肝纤维化趋势明显；虚证患者由于原本素体正气亏虚或久病正气消耗，其正气无力与邪气抗争，相关蛋白质组学研究显示肝细胞损害较轻，但细胞的正常合成功能受到了影响；综上所述，慢乙肝中医证候的蛋白质组学研究结果与中医理论在一定程度上相契合，这对阐述慢乙肝中医证候的客观化具有一定的指导性意义。

3 蛋白质组学研究揭示慢乙肝中医证候间差异的生物学基础

慢乙肝中医证候的准确判断是中医药对症治疗的关键和基础。慢乙肝的发生、发展是多环节、多因素参与的复杂过程，在分子水平上讲，不同的证侯是不同功能的蛋白质参与其中的结果。在研究慢乙肝不同中医证候差异性蛋白质的基础上发掘出辨证的标志性蛋白质，并通过对慢乙肝患者血清蛋白质进行鉴定、评估，可以在一定程度上提高中医辨证的准确度，实现辩证的“可量化”“精准化”，更易于使中医为现代医学所理解和接受。

周威龙等[36]筛选了慢乙肝脾胃湿热证、肝郁脾虚证、健康者的证候间差异蛋白，并对其进行了生物学功能研究，结果显示肝郁脾虚组和脾胃湿热组存在61个差异表达蛋白，其中16个表达上调，45个表达下调，两证型之间差异蛋白主要包含了脂肪酸代谢、视黄醇代谢、精脯氨酸代谢、丙-谷-天冬氨酸代谢、氧化磷酸化代谢以及与肝酶P-450相关的毒物和共栖代谢通路，它们和处于差异蛋白功能网图中交点位置的YWHAH、RhoA、RhoC、ATP5A1、ATP5B、CDH1蛋白都有可能是证候间差异的生物学基础。最近，笔者课题组[37]采用iTRAQ联合LC-MS/MS技术对慢乙肝肝郁脾虚、肝胆湿热、脾胃湿热证型进行研究，发现各证型之间存在差异蛋白表达，以及具有显著统计学差异的蛋白通路，并且差异蛋白功能表达也具有显著差异，这充分说明不同证型蛋白质功能发挥作用时的途径亦有不同，各证型均有不同的病理和转归过程，从而有效证明慢乙肝的传统中医辨证不是仁者见仁智者见智的凭空想象，而是有着深刻的微观生物学基础，这与现代西医的“物质可量化”观点之间不谋而合，充分佐证了中医的科学性和科学内涵。

4 问题与展望

蛋白质组学作为研究慢乙肝中医证候差异，提高辨证准确度和评估预后的重要手段已被中医界所广泛接受，并取得了丰富的成果，为慢乙肝辩证分型提供了可参考、可量化的指标，促进了中医辩证技术的客观化，为慢乙肝的辩证分型和辩证施药提供了重要参考和技术手段，但也应该看到目前仍存在许多不足之处，如：①当前大多数蛋白质组学研究纳入的病例数偏少，且揭示的结果难以得出统一的结论，还需要进一步扩大样本量进行更大范围的验证；②由于目前研究中发现的慢乙肝中医证候差异蛋白数量较多，暂时不能完全进行差异表达蛋白质结构和功能的鉴定，需进一步分析差异表达的蛋白质在慢乙肝发生和发展过程中的生物学意义，并发掘出辨证的标志性蛋白质；③慢乙肝中医证候蛋白质组学研究中发现的生物标志物尚依赖于进一步临床研究的证实，多种差异蛋白的作用机制尚不明晰，其在临床诊断、评估中的应用仍有待深入研究。不过，相信随着蛋白质组研究手段的不断进步和高通量筛选技术的发展，快速、低成本鉴定差异蛋白，实现蛋白与功能的一一对应将成为可能，这必将从根本上揭示慢乙肝证候的生物学基础，阐释慢乙肝中医证候的本质。

传统中医学的发展一直与临床实践联系密切，形成了“方证对应”的基本诊疗模式，客观上强调方剂与证候之间的一一对应关系，强调“辨证施药”，而蛋白质组学恰好从微观物质基础角度提供了中医证候的客观解释，使得辩证施药有了物质作用基础，这为中医理论的现代发展提供了有力支撑，因此，可以说蛋白质组学是唯物论在中医学中的体现和再实践。以蛋白质组学作为微观物质基础，“中医证候”与“方剂”形成了巧妙的对应关联，“蛋白质组学”“中医证候”和“方剂”三者之间形成了互为支撑的客观事实，其中“蛋白质组学”和“中医证候”之间的关系是：“蛋白质组学”揭示了“中医证候”的物质基础，“中医证候”为蛋白质组差异的外在体现；而“蛋白质组学”和“方剂”之间的关系是：蛋白质组是中药方剂中有效成分的作用靶点，中药多组分、多功能、多通路协同作用与蛋白质组中呈现的多作用靶点相对应和锲合；同时，“方剂”和“中医证候”之间的关系则是：“证候”是“方剂”的施药基础，而“方剂”则是“证候”的客观量化和解决对策；因此，在慢乙肝中医证候与蛋白质相关关系的基础上，我们应该重视和加入“方剂”的研究，这不仅有助于进一步认识慢乙肝中医证候与蛋白质组之间的关联性，并且方剂与蛋白质的作用及其在证候上的反映，更有助于理解蛋白质的作用靶点及作用机制，这可为创新药物的开发和慢乙肝病理机制的阐释提供更加丰富的数据和事实支撑。

此外，蛋白质组学与慢乙肝中医证候的关系研究，不应该被割裂和孤立，而应该在更大的视角下进行观察和深入思考，特别是近年来随着基因组学、代谢组学的发展，将蛋白质组学与之相关联，将有助于更全面、更宽阔的视角下理解研究慢乙肝中医证候与蛋白质组学的关联性，更加深刻的揭示慢乙肝中医证候的科学本质，从而真正实现中医理论的现代化，使得中医药发展迈向精准时代。