Ki-67、ToPoⅡα在宫颈病变中表达的比较及检出HSIL的价值分析

蒋朋朋 赵向荣 柯小宁

宫颈癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一。据研究统计，2018年全球估计有311365人因宫颈癌而致死，其中大概90%发生于发展中国家[1]。而宫颈病变是正常宫颈上皮发展至宫颈癌的重要中间阶段，其分级诊断在临床上较为困难。因此常需要借助分子生物学标志物辅助诊断，提高宫颈病变诊断的准确性[2]。Ki-67主要表达于增殖细胞的细胞核中，是评估细胞增殖的较好指标，常用于宫颈病变的分级诊断[3]。TopoⅡα是DNA拓扑异构酶的一种，能调节核酸结构,是DNA进行复制及转录的重要核酶[4]。目前TopoⅡα研究热点主要在于其可作为蒽环类药物的靶酶，常用于肿瘤耐药时预测蒽环药物化疗的敏感度[5]。但TopoⅡα的表达在细胞增殖和分裂中起着重要的作用，其蛋白水平的过表达反映细胞的增殖状态，也是一个特殊的细胞增殖标志物[6]。本研究通过免疫组化法研究Ki-67、TopoⅡα这两种细胞增殖标志物在宫颈病变组织中的不同表达情况并作比较，同时探讨其在检出宫颈高级别病变方面的价值。

材料与方法

1.一般资料：选取2018年1月～2019年1月因宫颈病变就诊于邯郸市中心医院门诊或住院部，进行宫颈活检或锥切的患者113例，作为观察组。其中CINⅠ46例、CINⅡ33例、CINⅢ34例。同时随机选取同一时段因子宫良性病变行手术治疗，病理诊断为宫颈正常组织者45例，作为对照组。入选患者年龄为35～65岁，平均年龄46.0±8.3岁，各组年龄比较差异无统计学意义。纳入标准：①35岁≤年龄≤65岁；②此前未接受过放化疗或分子靶向治疗；③临床、病理资料完整；④既往无宫颈癌及其他恶性肿瘤病史；⑤两名高年资病理医生复核诊断的病理分级结果一致。排除标准：①年龄<35岁或>65岁；②经期、孕期、哺乳期的女性；③临床、病理资料不完整；④有肿瘤相关的放化疗或其他基因靶向治疗史；⑤合并有重要脏器功能损伤；⑥两名病理医生的复核诊断结果不一致。本研究开始前均获得患者或家属的知情同意。本研究经邯郸市中心医院医学伦理学委员会批准通过。

2.研究方法：(1)试剂选择：所有符合条件的标本均已使用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋。选取符合标准的组织，对其蜡块进行4μm厚连续切片，应用免疫组织化学SP法染色，DAB显色，最后结果使用光镜进行观察。Ki-67兔抗人型单克隆抗体、鼠抗人型单克隆ToPoⅡα抗体购自上海信裕生物科技有限公司，免疫组化相关试剂购自上海如吉生物科技发展有限公司。实验操作步骤严格按试剂盒说明书进行。(2)免疫组化步骤:常规石蜡切片，做好标记，68℃烤箱烤片2h，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水, 采用高压锅高温修复抗原，3%双氧水灭活内源性过氧化物酶，每张切片上滴加适量一抗，4℃恒温过夜，再加入生物素标记的二抗，37℃恒温培养箱放置1h，DAB显色，苏木精溶液复染，标本脱水、透明，干燥后中性树胶封片[7]。每步均经准确的时间及恰当的温度孵育，均使用PBS缓冲液进行冲洗。阴性对照选择PBS染色替代一抗，阳性对照以宫颈癌染色结果为标准。

3.结果判读:Ki-67、ToPoⅡα的阳性表达均为细胞核内出现棕黄色或褐色颗粒。在低倍光镜下观察，选择5个阳性病变典型的区域，再在高倍镜下计数200个细胞中的阳性细胞数，取5个阳性细胞比例的均值确定最终阳性细胞比例。结果分为阴性(-):阳性细胞比例≤5%；弱阳性(+): 6%<阳性细胞比例≤25%; 中度阳性(++):25%<阳性细胞比例≤50%；强阳性(+++):阳性细胞比例>50%。

4.统计学方法:采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料采用百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验，期望计数<5时使用连续校正法或Fisher精确概率法计算。Ki-67、ToPoⅡα的阳性表达与宫颈病变程度的一致性采用Spearman等级相关性分析。Ki-67、ToPoⅡα检出HSIL的敏感度、特异性、准确率、阳性预测值、阴性预测值的比较采用配对χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Ki-67、ToPoⅡα在各组中阳性表达率的比较：Ki-67在对照组、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ组中的阳性表达率逐渐升高，分别为15.56%、45.65%、69.70%和94.12%，组间比较差异有统计学意义(χ2=53.03，P<0.05)。ToPoⅡα在各组中的阳性表达率依次为11.11%、34.78%、54.55%、88.24%和96.67%，组间比较差异有统计学意义(χ2=57.97，P<0.05)，详见表1、图1。

表1 各组中Ki-67、ToPoⅡα的阳性表达情况[n(%)]

图1 各组中Ki-67、ToPoⅡα的阳性表达情况(免疫组化，×200)

2.Ki-67、ToPoⅡα的阳性表达率与宫颈病变级别相关性比较：Ki-67、ToPoⅡα的阳性表达水平均与宫颈病变严重程度具有一致性，Spearman相关系数分别为0.670和0.647。即宫颈病变的级别越严重，Ki-67、ToPoⅡα的阳性表达率越高。两者均能反映宫颈病变的严重程度，一致性相当(P=0.000)。

3.Ki-67、ToPoⅡα检出HSIL的诊断价值比较：HSIL包括CINⅡ、CINⅢ级病变，Ki-67、ToPoⅡα以检出CINⅡ及CINⅢ级病变为阳性。阳性检出情况详见表2。其中在67例高级别病变组织中，Ki-67阳性例数55例，ToPoⅡα阳性例数48例。依据上述表格分别计算出Ki-67、ToPoⅡα检出HSIL敏感度、特异性、准确率、阳性预测值和阴性预测值，详见表3。Ki-67的敏感度、阴性预测值略高于ToPoⅡα，差异无统计学意义(P>0.05)。ToPoⅡα的准确率及阳性预测值略高于Ki-67，差异无统计学意义(P>0.05)。而ToPoⅡα的诊断特异性高于Ki-67，差异有统计学意义(P<0.05)。即在敏感度、准确率、阳性预测值、阴性预测值等方面，Ki-67与ToPoⅡα的诊断价值比较，差异无统计学意义。但是在特异性方面，ToPoⅡα的诊断价值略高于Ki-67，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 Ki-67、ToPoⅡα检出HSIL的阳性例数(n)

表3 Ki-67、ToPoⅡα的检出HSIL的诊断效能比较[n/n(%)]

讨 论

近年来，通过各种分子标志物协助肿瘤的诊断或分级成为各种肿瘤的研究热点。宫颈癌是一种女性常见的恶性肿瘤，而恶性肿瘤的特征是在细胞遗传过程中细胞分裂增强和无限制的分裂。在反映细胞增殖相关的核抗原中，应用最为广泛的是Ki-67。长期以来，关于ToPoⅡα的研究主要在肿瘤化疗的耐药性或者疗效的评估方面[8]。但有研究发现，ToPoⅡα的表达与Ki-67具有相关性，也可以反映肿瘤细胞的增殖状态[9]。研究显示，在临床治疗及判断预后等方面ToPoⅡα比Ki-67更具有特异性[10]。本研究旨在比较Ki-67、ToPoⅡα在各宫颈组织中的不同表达水平，探讨其对宫颈高级别病变的检出效能。

Ki-67主要表达于增殖细胞的细胞核中,而在静止期细胞不表达,是评估细胞增殖的较好指标[11]。Ki-67位于人类第10号染色体长臂，由两条多肽链组成，其中一条为345kDa，另一条为395kDa[12]。它能够识别细胞周期中核抗原上的一个抗原决定簇,在增殖细胞的G1、S、G2期表达,G0期不表达，与细胞的合成代谢有关[3]。Ki-67在细胞周期不断的增殖过程中受协调机制控制，若调控机制发生异常，则机体表达呈现出增殖紊乱的状态。因此Ki-67的高表达常表示细胞增殖活跃，可反映宫颈癌或者癌前病变[13]。尽管Ki-67已被用作细胞增殖的标志物和CIN分级的辅助物，但其参与的具体过程仍不明确[14]。

ToPoⅡα表达于细胞核,能调节核酸结构,是控制核酸生物功能的关键酶[15]。其可催化DNA双链结构的复制，属于DNA拓扑异构酶的一种。众所周知，肿瘤的发生、发展是肿瘤细胞过度增殖造成的，而肿瘤细胞过度增生，必然涉及到DNA复制增加和DNA损伤修复功能增加。DNA拓扑异构酶是真核生物细胞调控过程中一种必不可少的核酶，可催化DNA链的断裂和再结合，从而控制DNA的拓扑空间状态，在调节DNA超螺旋结构过程中发挥着重要作用[16]。当拓扑异构酶发生突变或缺失时，则会导致基因的复制、染色体分离等缺陷，可导致严重疾病的发生[17]。因此，ToPoⅡα在恶性肿瘤细胞中的高表达不仅反映了增殖活性的增强，还反映了质的改变，常提示病变比较严重[18]。

本研究结果发现，Ki-67在对照组中的阳性表达主要在基底层及副基底层，随着病变级别加重，Ki-67的表达层次逐渐由上皮下1/3层发展至上皮下2/3层及全层，阳性部位也由局灶阳性向弥漫阳性转变，这与施绒贤等[19]研究结果一致。同样，ToPoⅡα的阳性表达水平也随着宫颈病变的升级，表达越来越强。并且，在检出宫颈高级别病变方面，ToPoⅡα与Ki-67的敏感度比较，差异无统计学意义，但特异性较Ki-67高，差异有统计学意义，即在肿瘤细胞增殖方面ToPoⅡα的特异性优于Ki-67。但是由于本研究属于小样本研究，有待于扩大样本量来进一步分析探讨TopoⅡα与Ki-67在检出宫颈高级别病变的效能比较。

综上所述，TopoⅡα与Ki-67均可反映宫颈病变的级别，且呈正相关。但在检出宫颈HSIL方面，TopoⅡα的特异性高于Ki-67，在临床诊断上具有一定的指导意义。