子宫内膜VEGF在月经周期的表达变化研究

李 华 钱睿亚 李 蓉

目前，我国不孕不育患病人数已经高达7000万，育龄期夫妇的不孕不育发生率已升高至12%～15%[1]。正常血管生成在子宫内膜种植窗的开启和维持以及胚胎植入和发育过程中起着非常重要的作用，它可以促进子宫内膜间质水肿及蜕膜化发生[2]。参与子宫内膜血管生成的细胞因子主要有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)及血管生成素(angiogenin，ANG)。其中VEGF对子宫内膜血管生成起到关键作用，可极强地刺激血管内皮细胞增殖，同时也具有增加血管通透性的作用。子宫内膜VEGF在月经周期中的变化规律和调控机制至今尚未完全阐明。既往有通过研究哺乳动物子宫内膜标本和研究女性月经周期血清中VEGF的变化推测其在人子宫内膜的变化规律，但是结果存在争议。本研究旨在探索人子宫内膜VEGF在整个月经周期的表达变化。

对象与方法

1.研究对象及纳入排除标准：研究对象：收集2014年1月～2019年12月于首都医科大学附属北京妇产医院妇科及北京大学第三医院生殖医学中心行子宫内膜活检或宫腔镜检查的患者留取的子宫内膜标本。纳入标准：(1)月经规律(22～34天)，因男方因素不孕、超声监测有排卵。(2)检查前3个月未使用激素治疗。(3)取得患者知情同意。排除标准：(1)宫腔镜下可见子宫内膜炎、子宫内膜息肉、宫腔粘连、子宫纵隔等。(2)病理结果回报子宫内膜炎、子宫内膜息肉、子宫内膜增殖症等。(3)除外其他生殖系统疾病如多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、子宫肌瘤等。(4)除外内科合并症。

2.标本收集及处理：对因B超提示子宫内异常(如子宫内膜回声不均、宫腔积液、子宫内膜息肉等)为宫腔镜手术探查指征的患者，在行宫腔镜检查未探及宫腔异常后，使用一次性子宫内膜吸管行子宫内膜活检；对无宫腔镜探查指征但需行子宫内膜活检的患者直接采用一次性子宫内膜吸管行内膜活检。子宫内膜离体后立即用0.9%NaCl注射液冲洗干净表面血液，一份放入10%甲醛溶液固定，常规送病理检查；一份放入4%多聚甲醛溶液固定24h后用石蜡包埋，待行免疫组织化学染色；另一份置于5ml EP管中放于-80℃冰箱保存。宫腔镜手术、子宫内膜活检由固定两位医生完成。标本的收集、处理由另外1位医生完成，以保证结果的可靠性。

3.分组情况：依据内膜活检的月经周期时间收集月经期、增殖早期、增殖中期、增殖晚期的子宫内膜。对拟取分泌期子宫内膜的患者在行宫腔镜或子宫内膜活检的月经周期由固定两位医生行超声下卵泡监测，确定有排卵。所有入组标本均请两位病理科医生共同阅片。依据子宫内膜活检的月经周期时间、超声监测排卵情况及显微镜下切片图像特点，将子宫内膜分为7组，即组1(月经期)、组2(增殖早期)、组3(增殖中期)、组4(增殖晚期)、组5(分泌早期)、组6(分泌中期)和组7(分泌晚期)。

4.免疫组织化学染色及结果分析：将石蜡包埋组织做切片两张，一张行免疫组织化学染色，另一张行HE染色。每张切片在显微镜相同放大倍数下(×40)观察，采用佳能微成像系统在相同曝光时间、背景光源下随机选取2个视野拍摄照片，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对图片进行分析，测量每张切片的累积吸光度(A)值，对VEGF在子宫内膜整体表达进行分析。显微镜下着色颗粒为棕色定义为强阳性，黄色定义为阳性，淡黄色定义为弱阳性，未着色定义为阴性，对VEGF在子宫内膜腺体和间质的不同表达进行定性分析。

改革不断前行，形式不断变化，然而数学课堂始终应是思维主导的课堂．笔者从“直线与圆的位置关系”复习课中进一步体会到“为思维而教”的真正含义和做法，如鲠在喉不吐不快，特梳理成文，就教于同行．

增殖早期、增殖中期、分泌中期、分泌晚期子宫内膜VEGF mRNA表达相近。

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VEGF是子宫内膜血管内皮细胞增殖、血管生成和毛细血管通透性增加的主要调节因子[3]。cDNA序列研究表明VEGF存在着5种异构体，分别是VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206[4]。子宫内膜中VEGF来源于腺上皮细胞、间质细胞和血管内皮细胞[5]。此外，内膜组织中的巨噬细胞、间质中一些侵入的炎性细胞，如中性粒细胞、自然杀伤细胞也可以分泌VEGF[6]。VEGF有两种主要受体，分别是VEGFR1和VEGFR2，主要分布于血管内皮及腺上皮细胞[4]。女性月经周期中子宫内膜VEGF的表达调控机制目前尚未完全阐明，大部分研究显示其主要受缺氧和卵巢分泌的甾体激素调控。月经期内膜剥脱造成的缺氧刺激内膜间质细胞产生VEGF。在增殖期，逐渐升高的雌二醇(estrodiol，E2)作用于内膜间质及上皮细胞的雌激素受体，诱导VEGF的分泌进一步增加。进入分泌期，孕激素(progesterone，P)通过抑制雌激素受体，减轻雌激素对VEGF的作用[4]。此外，子宫内膜微环境中的一些细胞因子，如FGF、EGF等也可以通过自分泌和旁分泌的方式对VEGF的表达产生影响[5,6]。

1.入组情况：研究共入组113个标本，其中月经期标本20个，增殖早期15个，增殖中期16个，增殖晚期17个，分泌早期15个，分泌中期14个，分泌晚期16个。患者年龄为23～38岁，月经周期24～34天，各组平均年龄、月经周期比较，差异无统计学意义，详见表1。

结 果

3.子宫内膜VEGF mRNA相对表达量：不同分组子宫内膜VEGF mRNA相对表达量详见图2。增殖晚期子宫内膜VEGF mRNA表达显著增加，与各组比较差异有统计学意义(P<0.05)，而月经期及分泌早期子宫内膜VEGF mRNA表达显著减少(P<0.05)。

表1 不同组间子宫内膜A值及平均年龄、月经周期

2.图像分析结果：月经期子宫内膜VEGF表达最低，增殖早期、增殖中期表达增强，至增殖晚期表达最强，与其他各个时期的表达比较，差异有统计学意义(P=0.001)。分泌早期开始，VEGF的表达下降，较增殖晚期下降显著，差异有统计学意义(P=0.001)。到分泌中、晚期，VEGF表达再次升高。在月经周期中，月经期及分泌早期子宫内膜VEGF表达最低(P<0.05)，增殖晚期VEGF表达最大(P<0.05)，详见表1、图1。

图1 不同组间子宫内膜A值组4与各组比较，*P<0.05；组1与组5比较，P=0.10；组1和组5与其余各组比较，P<0.05

以瑞士洛桑酒店管理学院为代表的欧洲酒店管理专业教育一般采用的是“店中校，校中店”模式，即没有专门的实训基地，学校就是酒店、工作场所就是实训场所和教室、部门就是课程载体、经理就是老师、学生就是员工，这种多重融合的形式，使酒店运营与课程讲授一体、员工操作与学生实践一体、经理管理与教师传授一体，酒店和学校实现无缝隙全方位融合。

则T⨁V关于定义的运算构成保积Hom-Jordan李代数当且仅当ω为2-上圈,且α∘ρA([x,y])=ρA(x)∘ρA(α(y))-δ ρA(y)∘ρA(α(x))。

图2 不同组间子宫内膜VEGF mRNA相对表达量增殖晚期与各组比较，*P<0.05；月经期、分泌早期与其余各组比较，*P<0.05

5.RT-PCR技术分析子宫内膜VEGF mRNA表达：-80℃冰箱中取出子宫内膜组织，复溶后充分研磨，TRIzol法提取组织总RNA。取2μl总RNA利用紫外分光光度计检测RNA浓度及质量，合格样本按照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，后进行扩增、检测，计算相对表达量。VEGF以GAPDH为内参基因，在Genbank上查找目的基因mRNA序列，经计算机引物设计网站设计引物，由上海生物工程有限公司合成两对引物：GAPDH引物上游序列：5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，下游序列：5′-GGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3′，目的片段长度为112bp；VEGF引物上游序列：5′-GAGGGCAGAATCATCACG-3′，下游序列： 5′-TCCAGGGCATTAGACACC-3′，目的基因片段长度为432bp。VEGF的扩增条件为：94℃变性30s，56℃退火30s,72℃延伸1min，30个循环。

4.免疫组化结果：显微镜下可以观察到VEGF表达于子宫内膜腺体上皮细胞、间质及血管内皮细胞，表达定位于细胞质。VEGF在整个月经周期中都有表达，但是表达强度在各个时期有所不同：在月经期VEGF的表达呈弱阳性；进入增殖期后，内膜及间质都有强阳性的染色，增殖晚期着色明显较深；分泌早期染色减弱，以弱阳性染色为主，分泌中、晚期又开始出现强阳性。此外，VEGF在同一时期的内膜腺体与间质表达也略有差异：在月经期VEGF主要表达于间质细胞；在增殖期及分泌早期，同一切片的子宫内膜腺体染色较间质深；在分泌中、晚期，间质染色较腺体深。对于内膜腺体来说，整个增殖其及分泌早期为强阳性染色，分泌中期及晚期为弱阳性染色。对于内膜间质来说，月经期为弱阳性染色，增殖早、中期为阳性染色，增殖晚期为强阳性染色，分泌早期为阳性染色，分泌中、晚期为强阳性染色(图3)。

图3 月经不同时期VEGF的表达(HE染色，×100)g.腺体；s.间质；b.血管；A.VEGF表达于子宫内膜腺体、间质、血管上皮细胞；B.月经期(M2)内膜，VEGF在间质染色弱阳性；C.增生早期(M6)子宫内膜，VEGF染色加深，部分腺体染色强阳性；D.增生中期(M10)子宫内膜，部分腺体染色强阳性，腺体染色较间质深；E.增殖晚期(M15)子宫内膜：腺体及间质染色均有强阳性染色；F.分泌早期(M16)子宫内膜：VEGF表达开始降低；G.分泌中期子宫内膜(M22)：染色加强，VEGF在间质表达较腺体强；H.分泌晚期(M27)子宫内膜：间质染色增强

讨 论

6.主要试剂：VEGF为兔抗人1∶200，二抗为二步法通用山羊抗兔抗体，显色剂为DAB，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。TRIzol试剂及反转录试剂盒购自美国Gibco/BRL公司。DNA聚合酶、内参GAPDH及VEGF引物购自上海生物工程有限公司。

本研究结果显示，增殖期子宫内膜VEGF表达增加，到增殖晚期达到最大，这和月经周期中的E2水平变化一致。分泌早期开始后VEGF表达显著下降，可能与下降的E2水平有关。但在分泌期中期，VEGF表达再次升高，特别是内膜间质VEGF表达增强，这说明在此时期，VEGF的表达不只受E2、P的影响，其他因素如内膜间质中增加的细胞因子的调控可能也发挥了重要作用。

我国气电装机以5大发电集团为主，其气电发电量占全国的50%，其中华电集团、华能集团气电装机规模较大，2017年分别达到1432万千瓦和1042万千瓦。中国海油依托上游天然气产业的优势，开发建设了较多气电项目，装机总量达到846万千瓦。另外，京能、深能源、浙能和粤电等地方发电企业的气电装机总量也分别达到478、318、236和234万千瓦。国电、神华合并后，气电装机总量达到199万千瓦（见图3）。

关于子宫内膜VEGF的月经周期表达变化规律，既往研究结果存在很大争议，但是结果都显示其表达呈周期性变化。有研究将猕猴的子宫内膜作为研究对象，结果显示子宫内膜间质VEGF在增殖中期达到高峰，内膜腺体VEGF在分泌晚期表达最强[7]。Licht等[8]研究了54例不孕女性分泌期的子宫内膜，发现分泌晚期子宫内膜VEGF表达最大，VEGF与子宫蜕膜化发生密切相关。另有研究53例健康女性不同时期血清VEGF水平，发现其在排卵前达到高峰，此后略有下降，但分泌期仍维持在较高水平，这与本研究结果相似[9]。在月经周期中，增殖期是子宫内膜血管最密集的生成阶段，本研究结果也提示增殖晚期子宫内膜VEGF表达达到最大。增殖期VEGF表达的逐渐增加促进了子宫内膜血管的生成，从而促进子宫内膜的恢复、生长和向分泌期转化，为随后种植窗期胚胎的植入和发育提供必备条件。

子宫内膜容受性(endometrial receptivity，ER)是指子宫内膜接纳胚胎植入的一种综合状态，包括子宫内膜丰富的血供和子宫内膜腔上皮、腺上皮及间质的充分发育，它开启的时间是短暂的，仅在分泌中期的一小段时间[10]。ER的出现是诸多因素共同调控的结果，至今尚未完全阐明。在胚胎植入过程中，血管生成起到重要作用，因此，作为子宫内膜血管周期性生成过程中的关键调节因子，VEGF在ER调控过程中的作用也越来越被重视。近期研究表明，早期妊娠丢失和胚胎种植失败与子宫内膜VEGF表达下降有关。冯苗等[11]研究对比了IVF-ET失败患者和正常已育女性种植窗期的子宫内膜微血管密度与VEGF之间的差异，发现前者其内膜微血管密度与VEGF表达均低于正常女性，提示着床窗期内膜血管生成不良,可能是导致着床失败的原因之一。Sadekova等[12]研究对比了复发性流产及正常已育女性分泌期子宫内膜VEGF的表达，结果显示复发性流产患者子宫内膜VEGF较正常女性显著降低，且两组中黄体功能不全的患者其子宫内膜VEGF的表达更进一步降低，提示子宫内膜血管生成异常，可能是黄体期子宫内膜发育不成熟从而导致胚胎植入失败的原因。

本研究结果显示，月经期子宫内膜VEGF表达较低，进入增殖期后VEGF表达开始增强，增殖晚期达到高峰。增殖早、中期的VEGF通过促进血管内皮细胞增殖及血管形成，促进月经过后子宫内膜的修复和增殖。增殖晚期较高的VEGF水平，有利于其作用于内皮下的血管网，引起微血管进一步增殖和通透性增加，促进血浆自微血管流入到细胞间质，为随后ER的出现提供条件[13]。进入分泌期，VEGF在短暂下降后在中、晚期的表达再次上升，维持在较高水平，且内膜间质VEGF的表达呈强阳性，提示VEGF可能在此时与子宫内膜微环境中的细胞因子互相作用，进而参与ER的构建，对胚胎的植入及内膜蜕膜化的发生产生影响[14]。

审计诉讼是会计师事务所面临的巨大威胁，一旦出现审计诉讼，事务所的客户就会流失，声誉受损。所以为了减少审计诉讼的可能性，事务所就会想尽一切办法地提高审计质量。

近年来辅助生育技术在不断发展，但其临床妊娠率与持续妊娠率都分别只有44%和41%[15，16]。雌孕激素与局部细胞因子对VEGF的调控与子宫内膜容受性的出现及胚胎的植入密切相关，这为在临床治疗中，寻找评估及改善子宫内膜容受性、提高妊娠率的方法提供了新思路。既往研究多关注子宫内膜厚度和分型与ER的关系，近年来多项研究认为子宫内膜血流也与ER密切相关。子宫内膜血流丰富者，其胚胎种植率及临床妊娠率高，用彩色超声多普勒能量图记录子宫内膜血流可以更好地评估子宫内膜容受性，对体外受精胚胎移植妊娠结局有更好的预测作用[17]。Yu等[18]研究显示，使用外周血单核细胞进行宫腔灌注治疗后可提高着床障碍小鼠子宫内膜VEGF的表达，改善子宫内膜容受性。此外，通过使用芬吗通、低分子肝素、低剂量阿司匹林和西地那非等方法，也可以增加子宫内膜血流、提高临床妊娠率[19]。

综上所述，子宫内膜VEGF在月经周期呈周期性变化，增殖晚期表达最强，月经期及分泌早期表达最低，增殖早、中期及分泌物中、晚期处于较高水平。未来需进一步探索VEGF表达的调控因素，为探索评估子宫内膜容受性新指标及提高不孕症患者临床妊娠率的方法提供新思路。