LINC00511表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡影响及机制

黄顺德 李晓华 朱浩图

[摘要] 目的 探討长基因间非编码RNA 00511（LINC00511）在鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响和分子机制。

方法 采用实时定量PCR（RT-qPCR）分析鼻咽癌组织和癌旁组织中LINC00511和miR-590-3p表达水平。应用双荧光素酶报告实验和RT-qPCR分析LINC00511对miR-590-3p调控作用。将鼻咽癌细胞SUNE-1分为si-NC组、si-LINC00511组、si-LINC00511+anti-miR-NC组、si-LINC00511+anti-miR-590-3p组。使用集落形成实验、细胞计数试剂盒（CCK-8）、流式细胞术检测细胞克隆形成数、活力以及周期分布和凋亡率。

结果 鼻咽癌组织中LINC00511表达水平高于癌旁组织，miR-590-3p表达水平低于癌旁组织（t=42.522、69.402，P<0.05）。miR-590-3p是LINC00511的靶基因。与si-NC组比较，si-LINC00511组SUNE-1细胞中miR-590-3p表达显著升高，克隆形成数、存活率、S期细胞比例显著降低，细胞凋亡率、G 0/G 1期细胞比例显著升高（t=22.989～56.236，P均<0.05）。与si-LINC00511+anti-miR-NC组比较，si-LINC00511+anti-miR-590-3p组SUNE-1细胞克隆形成数、存活率、S期细胞比例显著升高，细胞凋亡率、G 0/G 1期细胞比例显著降低（t=12.483～29.825，P均<0.05）。

结论 鼻咽癌组织中LINC00511呈高表达。干扰LINC00511表达可通过负调控miR-590-3p抑制鼻咽癌细胞增殖，诱导其凋亡。

[关键词] 鼻咽癌;RNA，长链非编码;微RNAs;细胞增殖;细胞凋亡

[中图分类号] R739.63;R342.2

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）06-0897-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.195

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211230.1016.001.html;2021-12-30 14：27：54

EFFECT OF LINC00511 EXPRESSION ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF NASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELLS AND ITS MECHANISM

HUANG Shunde， LI Xiaohua， ZHU Haotu

（Department of Otolaryngology， Zhengzhou Central Hospital， Zhengzhou 450000， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression of long intergenic non-coding RNA 00511 （LINC00511） in nasopharyngeal carcinoma， as well as its effect on the proliferation and apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells and the related molecular mechanism.

Methods Quantitative real-time PCR （RT-qPCR） was used to measure the expression levels of LINC00511 and miR-590-3p in nasopharyngeal carcinoma tissue and adjacent tissue， and dual-luciferase reporter assay and RT-qPCR were used to analyze the regulatory effect of LINC00511 on miR-590-3p. Nasopharyngeal carcinoma SUNE-1 cells were divided into si-NC group， si-LINC00511 group， si-LINC00511+anti-miR-NC group， and si-LINC00511+anti-miR-590-3p group， and colony formation assay， CCK-8 assay， and flow cytometry were used to measure the number of cell colonies， cell viability and cell cycle distribution， and apoptosis rate.

Results The expression level of LINC00511 in nasopharyngeal carcinoma tissue was significantly hig-her than that in adjacent tissue， while the expression level of miR-590-3p in nasopharyngeal carcinoma tissue was significantly lower than that in adjacent tissue （t=42.522，69.402;P<0.05）. miR-590-3p was the target gene of LINC00511. Compared with the si-NC group， the si-LINC00511 group had a significant increase in the expression of miR-590-3p in SUNE-1 cells， significant reductions in the number of cell colonies， cell viability， and the proportion of cells in S phase， and significant increases in cell apoptosis rate and the proportion of cells arrested in G 0/G 1 phase （t=22.989-56.236，P<0.05）. Compared with the si-LINC00511+anti-miR-NC group， the si-LINC00511+anti-miR-590-3p group had significant increases in the number of cell colonies， cell viability， and the proportion of cells in S phase and significant reductions in cell apoptosis rate and the proportion of cells arrested in G 0/G 1 phase （t=12.483-29.825，P<0.05）.

Conclusion LINC00511 is highly expressed in nasopharyngeal carcinoma tissue. Interfe-rence with LINC00511 can inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells and induce cell apoptosis through negative re-gulation of miR-590-3p.

[KEY WORDS]nasopharyngeal carcinoma; RNA， long noncodin; microRNAs; cell proliferation; apoptosis

鼻咽癌（NPC）是一种起源于鼻咽上皮的高度恶性肿瘤，全球癌症统计数据显示，2018年全球NPC新增病例高达12.9万例，且90%病例发生在经济欠发达地区，其中中国南部、东南亚和北非发病率较高[1]。由于放化疗抵抗、复发和远处转移等原因，晚期NPC病人的治疗效果不尽人意，5年存活率低于60%[2]。因此，研究NPC进展的分子机制对制定有效的治疗策略具有重要的意义。长链非编码RNA（lncRNA）长度超过200个核苷酸，其通过调节细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、耐药和血管生成在肿瘤进展中发挥重要作用[3-5]。长基因间非编码RNA 00511（LINC00511）可以增强乳癌细胞干性，促进肿瘤发生[6]。敲减LINC00511可降低非小细胞肺癌细胞生存能力、加速细胞凋亡[7]。同时，miR-590-3p与LINC00511存在潜在相互作用。已有研究结果证实，NPC组织中miR-590-3p表达降低并促进鼻咽癌细胞的增殖和侵袭[8]。在既往研究的基础上，本研究首次探讨LINC00511对NPC细胞增殖和凋亡的调控作用，并以miR-590-3p为靶点探讨其作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 組织来源 收集2016年2月—2018年2月间于我院行组织病理活检的41例NPC组织及对应的癌旁组织（正常鼻黏膜组织），其中男性31例，女性10例，年龄45～70岁，平均年龄（53.6±1.5）岁。所有NPC病人术前未接受放疗或（和）化疗。所有组织样本离体后立即置于液氮中保存。本研究获得我院伦理学委员会批准且所有病人知情同意。

1.1.2 细胞和主要试剂 NPC细胞SUNE-1购于中国科学院上海细胞研究所;逆转录酶以及SYBR Premix Ex Taq购于大连Takara生物公司;小干扰RNA（si-RNA）、miRNA抑制物（anti-miRNA）、荧光素酶报告基因载体均由上海吉玛制药公司提供;细胞计数试剂盒（CCK-8）购于北京索莱宝公司;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）双染法凋亡检测试剂盒购于上海贝博生物公司;兔源半胱氨酸蛋白酶3前体（pro-caspase3）多克隆抗体（货号：ab44976）、兔源裂解的caspase3（Cleaved-caspase3）多克隆抗体（货号：ab2302）购于上海艾博抗生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实时定量PCR（RT-qPCR）检测LINC00511和miR-590-3p表达 NPC组织、癌旁组织中加入TRIzol试剂提取总RNA，用双蒸水溶解RNA样品，紫外线分光光度法测定RNA浓度。逆转录酶合成cDNA作为PCR模板，利用SYBR Premix Ex Taq进行RT-qPCR反应。扩增参数：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环。以GAPDH作为LINC00511内参对照，以U6作为miR-590-3p内参对照，使用2-ΔΔCt法分析LINC00511和miR-590-3p的相对表达量。所用引物及其序列见表1。

1.2.2 细胞培养和实验分组 SUNE-1细胞采用含有体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基（美国gibco公司，货号：12800017）、在37 ℃含体积分数0.05 CO 2培养箱中培养。细胞融合达到80%时进行消化传代，每2 d换液1次。将对数期SUNE-1细胞按照每孔2×105个细胞的密度接种于6孔板，当细胞达50%融合时进行脂质体转染并将细胞分为以下4组：si-NC组（a组）、si-LINC00511组（b组）、si-LINC00511+anti-miR-NC组（c组）和si-LINC00511+anti-miR-590-3p组（d组）。参照RT-qPCR步骤检测转染效果，合格后进行后续实验。

1.2.3 集落形成实验检测克隆形成数 每组取1×103个细胞均匀铺在6孔板，常规培养10 d左右，当看到集落时弃去上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次。用40 g/L多聚甲醛固定，结晶紫染色。弃去染色液，风干后在光镜下观察克隆形成数（大于50个细胞认为是有效克隆）。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力 以每孔3×103个细胞加入96孔板，培养48 h后按照试剂盒说明书加入CCK-8试剂。用酶标仪测定450 nm波长处的光密度（OD）值。细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率和周期分布①细胞凋亡测定：以预冷的PBS洗涤细胞2次，用500 μL的Annexin结合缓冲液重悬细胞并调整密度为1×109/L的细胞悬液。加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，室温下于暗室内孵育15 min。流式细胞仪检测细胞凋亡变化。②细胞周期测定：每组取1×104个细胞，预冷的PBS洗涤细胞2次，随后用体积分数0.75乙醇4 ℃下固定细胞24 h。加入PI室温孵育20 min。流式细胞术分析G 0/G 1、S、G 2/M期细胞比例。

1.2.6 免疫印迹法（Western blot）检测Cleaved-caspase3和pro-caspase3蛋白表达 用RIPA缓冲液提取总蛋白，以BCA法测定浓度后，按照每孔加样25 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和湿法转膜。用50 g/L脱脂牛奶室温下封闭膜2 h。分别与1∶1 000稀释的抗Cleaved-caspase3抗体、抗pro-caspase3抗体、抗GAPDH抗体在4 ℃下孵育膜过夜。室温下与1∶5 000稀释的山羊抗兔IgG二抗孵育膜2 h。使用增强型化学发光显色试剂盒进行显影。以GAPDH为内参照，计算目的蛋白的相对表达量。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验 将含有miR-590-3p结合位点的LINC00511野生型（WT）或突变型（MUT）序列插入荧光素酶报告的质粒，合成WT-LINC00511和MUT-LINC00511。然后，将miR-590-3p mimics、miR-NC分别与上述荧光素酶报告载体转染SUNE-1细胞，双荧光素酶报告基因检测系统测定转染48 h后荧光素酶活性变化。

1.3 統计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行分析。计量资料数据以±s表示，两组均数比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00511和miR-590-3p在鼻咽癌组织表达

RT-qPCR检测结果显示，LINC00511在鼻咽癌组织（4.16±0.27）中的表达水平明显高于癌旁组织（1.00±0.11），差异具有统计学意义（t=42.522，P<0.05）。miR-590-3p在鼻咽癌组织（0.17±0.04）中的表达水平明显低于癌旁组织（1.01±0.12），差异具有统计学意义（t=69.402，P<0.05）。

2.2 干扰LINC00511对SUNE-1增殖和凋亡影响

RT-qPCR检测结果显示，与si-NC组比较，si-LINC00511组SUNE-1细胞中LINC00511表达显著降低，miR-590-3p表达显著升高，差异具有统计学意义（t=23.778、56.236，P<0.05）。Western blot检测结果显示，与si-NC组比较，si-LINC00511组SUNE-1细胞pro-caspase3蛋白表达显著降低，Cleaved-caspase3蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义（t=18.904、23.525，P<0.05）。与si-NC组比较，si-LINC00511组SUNE-1细胞克隆形成数、存活率、S期细胞比例均显著降低，细胞凋亡率、G 0/G 1期细胞比例均明显升高，差异均具有统计学意义（t=22.989～51.403，P<0.05）。见图1、2和表2。

2.3 LINC00511与miR-590-3p的靶向关系

在DIANA工具中预测LINC00511靶基因显示，LINC00511序列中含有与miR-590-3p互补结合的位点。见图3。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-590-3p mimics和WT-LINC00511共转染组SUNE-1细胞相对荧光素酶活性（0.15±0.01）较miR-NC和WT-LINC00511共转染组（0.98±0.04）显著降低（t=34.867，P<0.05）;而miR-590-3p mimics和WT-LINC00511共转染组SUNE-1细胞相对荧光素酶活性（0.99±0.03）与miR-NC和WT-LINC00511共转染组（0.94±0.04）比较差异无显著意义（t=1.732，P>0.05）。

2.4 抑制miR-590-3p并干扰LINC00511表达对SUNE-1增殖和凋亡的影响

与si-LINC00511+anti-miR-NC组相比较，si-LINC00511+anti-miR-590-3p组SUNE-1细胞克隆形成数、存活率和S期细胞比例均显著升高，G 0/G 1期细胞比例则显著降低，差异有统计学意义（t=12.483～26.750，P<0.05）。而与si-LINC00511+anti-miR-NC组相比较，si-LINC00511+anti-miR-590-3p组SUNE-1细胞miR-590-3p表达水平显著降低，Cleaved-caspase3蛋白表达和凋亡率也显著降低，pro-caspase3蛋白表达显著升高，差异均具有统计学意义（t=17.816～39.246，P<0.05）。见图4、5和表3。

3 讨论

NPC是一种复杂的疾病，其发生与EB病毒感染、环境因素和遗传易感性等多种因素有关[9-10]。近年来，lncRNA因其在遗传、表观遗传、转录或转录后水平调控基因在癌症进展中作用引起肿瘤研究者的广泛关注，多项研究表明lncRNA可作为癌症治疗的潜在靶点[11-13]。本研究探讨LINC00511在NPC进展中作用显示，NPC组织中LINC00511表达水平较癌旁组织显著升高。转染si-LINC00511干扰其表达可显著降低SUNE-1细胞的克隆形成能力和降低细胞存活率，抑制细胞周期从G 0/G 1期向S期推进，具有抗增殖作用。caspase3活化可剪切细胞凋亡过程中的许多关键蛋白，是参与细胞凋亡的关键执行因子[14]。本文的研究结果表明，干扰LINC00511还可抑制pro-caspase3蛋白表达，促进Cleaved-caspase3蛋白表达，并诱导细胞凋亡，说明干扰LINC00511可能通过caspase3依赖途径诱导细胞凋亡。已有研究结果显示，干扰LINC00511表达可以降低卵巢癌细胞活力和克隆形成能力[15]。乳癌中LINC00511表达上调可以通过加速细胞G 1期向S期过渡和抑制细胞凋亡来促进肿瘤生长[16]。干扰LINC00511通过上调miR-765表达对舌鳞状细胞癌进展具有抑制作用[17]。本文研究结果证实，LINC00511在NPC表达上调，干扰LINC00511表达可有效降低NPC细胞的增殖能力，并提高细胞凋亡率。

大量研究证实，lncRNA可以吸附miRNA抑制其表达或活性进而影响下游靶基因表达发挥作用[18-20]。LINC00511在乳癌、胰腺导管腺癌以及胶质瘤中的致癌作用均与吸附miRNA有关[21-23]。miR-590-3p在多种人类癌症中发挥功能作用。既往研究报道，卵巢癌、结肠癌中miR-590-3p表达升高并参与癌细胞的增殖和转移[24-25]。然而，在乳癌中过表达miR-590-3p可抑制癌细胞存活并触发细胞凋亡[26]。本文研究结果表明，NPC组织中miR-590-3p表达显著降低，与ZHENG等[8]研究结果一致。此外，本研究通过双荧光素酶报告基因实验和RT-qPCR证实，LINC00511对miR-590-3p具有靶向负性调控作用。由于既往研究证实过表达miR-590-3p可降低NPC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制肿瘤生长和转移，于是推测LINC00511可能通过靶向miR-590-3p在NPC中发挥作用[8]。而将anti-miR-590-3p和si-LINC00511共转染SUNE-1细胞进行恢复实验的结果显示，抑制miR-590-3p表達可显著降低干扰LINC00511对SUNE-1细胞的克隆形成、存活、周期分布、凋亡以及pro-caspase3和Cleaved-caspase3蛋白表达的影响，恢复SUNE-1细胞的增殖能力和凋亡水平，这进一步说明靶向负调控miR-590-3p是LINC00511在NPC中发挥致癌作用的重要途径。

综上所述，干扰LINC00511通过靶向负调控miR-590-3p可抑制NPC细胞增殖并诱导细胞凋亡。因此，LINC00511是NPC的潜在治疗靶点，这为进一步开发针对LINC00511的NPC治疗策略奠定理论基础。然而，本研究仅为体外细胞实验，尚有待于动物实验来验证LINC00511的功能。

[参考文献]

[1]BRAY F， FERLAY J， SOERJOMATARAM I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA： a Cancer Journal for Clinicians， 2018，68（6）：394-424.

[2]LAN M， CHEN C Y， HUANG Y， et al. Neoadjuvant chemo-therapy followed by concurrent chemoradiotherapy versus concurrent chemoradiotherapy alone in nasopharyngeal carcinoma patients with cervical nodal necrosis[J].Scientific Reports， 2017，7：42624.

[3]刘珂，侯毅，郑稼. LncRNA MEG3对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响[J].郑州大学学报（医学版）， 2018，53（1）：56-59.

[4]LI J， MENG H， BAI Y， et al. Regulation of lncRNA and its role in cancer metastasis[J].Oncology Research， 2016， 23（5）：205-217.

[5]任开明. 长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1对肺鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响[J].实用临床医药杂志， 2019，23（9）：1-4，8.

[6]LU G M， LI Y Y， MA Y F， et al. Long noncoding RNA LINC00511 contributes to breast cancer tumourigenesis and stemness by inducing the miR-185-3p/E2F1/Nanog axis[J].Journal of Experimental & Clinical Cancer Research： CR， 2018，37（1）：289.

[7]ZHU F Y， ZHANG S R， WANG L H， et al. LINC00511 promotes the progression of non-small cell lung cancer through downregulating LATS2 and KLF2 by binding to EZH2 and LSD1[J].European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2019， 23（19）：8377-8390.

[8]ZHENG Z Q， LI Z X， ZHOU G Q， et al. Long noncoding RNA FAM225A promotes nasopharyngeal carcinoma tumorigenesis and metastasis by acting as CeRNA to sponge miR-590-3p/miR-1275 and upregulate ITGB3[J].Cancer Research， 2019，79（18）：4612-4626.

[9]梁兆坚，叶裕丰，何卓南. EB病毒抗体联合应用CT及MRI对鼻咽癌诊断价值[J].医学影像学杂志， 2019，29（8）：1288-1291.

[10]HUANG S N， TSAO S， TSANG C. Interplay of viral infection， host cell factors and tumor microenvironment in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma[J].Cancers， 2018，10（4）：106.

[11]冯双苗，杨贺佳，袁银花，等. LncRNA CASC2与miR-155-5p的靶向关系及对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭能力的影响[J].郑州大学学报（医学版）， 2020，55（2）：243-247.

[12]王献，王海兵. 食管鳞癌组织中lncRNA UCA1表达及其对癌细胞黏附和迁移影响[J].青岛大学学报（医学版）， 2020，56（3）：355-358.

[13]李思维.长链非编码RNA（lncRNA）在癌症中的作用[J].实用肿瘤学杂志， 2019，33（5）：471-475.

[14]刘莎，吴明，邸琨，等. 人脐带间充质干细胞条件培养液通过线粒体凋亡通路对抗Aβ诱导的原代皮质神经元凋亡[J].河北医科大学学报， 2019，40（4）：390-395，410.

[15]WANG J， TIAN Y J， ZHENG H， et al. An integrated analysis reveals the oncogenic function of lncRNA LINC00511 in human ovarian cancer[J].Cancer Medicine， 2019，8（6）：3026-3035.

[16]ZHANG J， SUI S Y， WU H， et al. The transcriptional landscape of lncRNAs reveals the oncogenic function of LINC00511 in ER-negative breast cancer[J].Cell Death & Disease， 2019，10：599.

[17]DING J H， YANG C X， YANG S. LINC00511 interacts with miR-765 and modulates tongue squamous cell carcinoma progression by targeting LAMC2[J].Journal of Oral Pathology & Medicine， 2018，47（5）：468-476.

[18]龙翔宇，周伟，江波，等. 长链非编码RNA FTX靶向miR-21-3p对肝癌细胞生长侵袭和迁移调控作用[J].中华肿瘤防治杂志， 2019，26（17）：1244-1250.

[19]皮益苑，周爽，简鸣，等. LncRNA中miRNA海绵活性与肿瘤的研究进展[J].中南医学科学杂志， 2019，47（3）：230-234.

[20]LUO H， XU C， LE W， et al. lncRNA CASC11 promotes cancer cell proliferation in bladder cancer through miRNA-150[J].Journal of Cellular Biochemistry， 2019，120（8）：13487-13493.

[21]LIU L， ZHU Y， LIU A M， et al. Long noncoding RNA LINC00511 involves in breast cancer recurrence and radioresistance by regulating STXBP4 expression via miR-185[J].European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2019， 23（17）：7457-7468.

[22]ZHAO X H， LIU Y M， LI Z H， et al. Linc00511 Acts as a competing endogenous RNA to regulate VEGFA expression through sponging hsa-miR-29b-3p in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2018， 22（1）：655-667.

[23]LI C， LIU H J， YANG J P， et al. Long noncoding RNA LINC00511 induced by SP1 accelerates the glioma progression through targeting miR-124-3p/CCND2 axis[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2019， 23（6）：4386-4394.

[24]SALEM M， O’BRIEN J A， BERNAUDO S， et al. miR-590-3p promotes ovarian cancer growth and metastasis via a novel FOXA2-versican pathway[J].Cancer Research， 2018，78（15）：4175-4190.

[25]FENG Z Y， XU X H， CEN D Z， et al. miR-590-3p promotes colon cancer cell proliferation via Wnt/β-catenin signaling pathway by inhibiting WIF1 and DKK1[J].European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2017， 21（21）：4844-4852.

[26]ABDOLVAHABI Z， NOURBAKHSH M， HOSSEINKHANI S， et al. MicroRNA-590-3P suppresses cell survival and triggers breast cancer cell apoptosis via targeting sirtuin-1 and deacetylation of p53[J].Journal of Cellular Biochemistry， 2019，120（6）：9356-9368.

（本文編辑 于国艺）