利用多重PCR和快提DNA结合快速鉴定甜瓜杂种纯度

贺玉花 户克云 赵光伟 孔维虎 张健 徐永阳

摘    要：纯度是决定种子质量的重要指标之一。以众天10号和其父母本为研究材料，将快提DNA法与多重PCR法相结合，成功建立一套三重PCR甜瓜杂种纯度快速鉴定体系。采用碱裂解快速提取DNA的方法，可以在5 min内提取96个DNA;采用三重PCR，能有效克服单一PCR在种子纯度鉴定中速率慢的缺陷。试验中SSR分子鉴定众天10号杂交种纯度为100%，与田间鉴定结果一致。为甜瓜乃至作物杂种种子的纯度鉴定提供了一套精度更高、速度更快、成本更低的技术体系。

关键词：甜瓜;SSR;多重PCR;快提DNA;纯度鉴定

中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）12-023-05

Abstract： Purity is one of the most important indicators of seed quality. A hybrid Zhongtian No. 10 and their parents were used in this study; and by combining the rapid DNA extraction method with the multiple PCR， a triple PCR purity identification system of hybrid seeds in melon was established. The rapid alkaline lysis method was used to extract the genome DNA， which can extract the genomic DNA of 96 samples in five minutes. The triplex PCR could effectively overcome the shortcomings of the single-PCR with slow speed in seed purity identification. The result of SSR molecular identification was that the purity of the Zhongtian No. 10 hybrid was 100%， and it was no significant difference with field identification. This study provides a technical system with the advantages of high-accuracy， rapid and low-cost for the purity identification of hybrid seeds in melon and other crop.

Key words： Melon; SSR; Multiplex PCR; Rapid DNA extraction; Purity identification

甜瓜（Cucumis melo L.）又名蜜瓜或香瓜，原产于印度、非洲热带沙漠地区[1-2]，是喜温、耐热性较强的一年生蔓生作物。中国甜瓜面积占世界总面积的45%以上，产量占55%以上[3]，是我国重要的经济水果之一。市面上销售的甜瓜种子大部分为杂交1代，而种子纯度是生产和销售过程中重要的指标之一。目前，种子纯度的检测方法主要采用传统的田间形态学方法，周期较长且花费较高，受自然环境条件影响大。分子标记鉴定技术具有周期短、准确度高等优点[4]。简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）是目前最常用的纯度鉴定标记之一，具有多态性、共显性和高度重复性等优点，被广泛应用于许多作物的杂种纯度鉴定[4-13]。

在利用SSR分子标记鉴定杂种纯度的过程中，DNA提取和PCR扩增是关键的步骤。传统的DNA提取方法试验操作复杂，费时费力，改良后的碱裂解快提DNA方法可在5 min提取96个DNA，大大缩短鉴定周期[14]。在杂种纯度鉴定过程中，一般需要2～3对引物才能准确鉴定出杂种的纯度，而传统的PCR反应一般加入1对引物。多重PCR（multiplex PCR）可以在同一PCR反应体系里加入2对及以上标记，能同时扩增出多个核酸片段，以尽可能少的消耗获得尽可能多的遗传信息，被广泛应用在多种作物杂种纯度鉴定中[15-17]。胡倩梅等[15]利用多重PCR对甜瓜杂交1代品种进行纯度鉴定，多重PCR相较于单一PCR能够缩短工作时间，减少试剂消耗，增加鉴定的准确性。目前，快提DNA方法在白菜[18]等作物杂种纯度鉴定中得到应用，在甜瓜种子纯度的检测中尚未得到应用，更没有和多重PCR结合，快提DNA的质量是否满足多重PCR对于DNA质量的要求，有待进一步研究。

笔者以众天10号杂交种为材料，利用多重PCR和快提DNA法结合快速鉴定甜瓜杂种纯度，结合田间鉴定进行验证，建立一套快速、准确的纯度鉴定体系。此方法不仅提高了纯度鉴定的准确性，而且大大缩短了鉴定周期，保障了农民和销售商的利益。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2020年9—12月在中国农业科学院郑州果树研究所进行。供试材料为杂交甜瓜品种众天10号及其相对应的亲本：母本P1和父本P2，其中P1和P2为中国农业科学院郑州果树研究所甜瓜育种课题组选育的高代自交系。

1.2 试验材料种植

选取籽粒饱满无伤的种子，众天10号种子200粒，亲本种子各20粒，55 ℃温汤浸种4 h，播种于事先装有吸好水的紅色陶土的保鲜盒内，播种后在种子上盖上一层吸好水的红色陶土，用保鲜膜将保鲜盒密封保水（留有少量通气孔），放置于光照培养箱（全日照，温度30 ℃）中育苗。待种子破土后，揭去保鲜膜，在种子表面适当喷洒水分，保持陶土湿润即可。待子叶完全展开，进行取样鉴定。

田间种植纯度鉴定：父母本各种植10株作为杂种植株表型性状对比，每个小区种植杂种1代植株100株，3次重复，在果实充分发育成熟时观察并统计植株表型性状、进行纯度鉴定。

1.3 DNA提取方法

DNA提取采用改良的碱裂解快提DNA法[14]，具体如下：首先将96孔PCR板（板1）放在事先存放在-20 ℃冰箱的冰盒上，并用连打枪加入每孔80 μL的灭菌TE缓冲溶液（0.05 mol·L-1 Tris-HCl（pH=7.0）+0.1 mmol·L-1 EDTA）;用镊子撕取面积约为0.3 mm2的甜瓜子叶叶片组织，放入另一块放在冰盒上的96孔PCR板（板2）中;将放入叶片的PCR板（板2）中每孔分别加入2个直径为2 mm的小钢珠;用连打枪在放有叶片组织的96孔板（板2）中加入100 μL 0.25 mol·L-1的NaOH溶液;用硅胶垫盖在加入叶片、小钢珠和NaOH溶液的PCR板上，并放到组织研磨器中将其固定;用组织研磨器在频率55 Hz、时长60 s的设置下将叶片捣碎，用排枪快速吸取8 μL组织研磨液加入到事先准备好的有80 μL的TE缓冲溶液的PCR板（板1）中，用排枪吸打均匀，并用离心机（2000 r·min-1）离心2 min，放于4 ℃冰箱保存待用。此过程需要注意的是加入NaOH溶液后的操作必须在5 min之内完成。

1.4 SSR分析及多重PCR引物组合的选择

SSR引物来源于Cucurbit Genomics Database网站（网址：http：//www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi），由上海生物工程有限公司合成。将覆盖甜瓜全基因组的326对SSR引物分别在2个亲本间进行多态性筛选，根据差异引物产物的片段大小，选择引物间产物片段大小相差60 bp及以上的引物组合，进行多重PCR扩增[15]。

1.5 PCR程序及电泳检测

普通PCR反应体系及程序：反应体系（10 μL）包含：Magic Mix×2.0 5 μL，无菌去离子水3 μL，引物（10 μmol·μL-1） 1 μL，DNA模板（50 ng·μL-1） 1 μL。扩增程序：94 ℃变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸7 min。4 ℃保存。

多重PCR反应体系及程序：选择3对SSR标记进行多重PCR扩增，反应体系（10 μL）包含：Magic Mix×2.0 5 μL，无菌去离子水1 μL，3对SSR引物（10 μmol·μL-1） 各1 μL（上游引物和下游引物各0.5 μL）共3 μL，DNA模板（50 ng·μL-1）1 μL。扩增程序：采用Touch-down扩增程序，94 ℃变性5 min;94 ℃变性30 s，65～56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，10个循环，每个循环退火温度降低1 ℃;94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，27个循环;72 ℃延伸7 min。4 ℃保存。

PCR反应产物加2 μL 6×loading buffer上样，用8%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，每个点样孔上样量1.5 μL，200 V恒电压电泳1.5 h。采用快速银染法进行检测。

1.6 分子标记的纯度鉴定结果与田间纯度鉴定结果的比较

分子标记纯度鉴定：根据PCR产物的电泳条带，只具有母本带型的后代为假杂种，具有父本和母本合并特征带型的为真杂种，统计真杂种和假杂种的数量，计算杂交种纯度。分子标记鉴定品种纯度/%=（真杂种数/总检测数）×100。

田间纯度鉴定：根据株型、果實性状等形态指标进行鉴定，取3个重复数据的平均值为最终的田间鉴定结果。最终将分子标记纯度鉴定结果与田间鉴定结果进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 亲本间SSR引物筛选

将覆盖甜瓜全基因组的326对SSR引物分别在2个亲本间进行多态性筛选，其中，79对引物在亲本之间显示出多态性，多态性比率为24.23%。

2.2 多重PCR组合的建立和扩增条件筛选

从79对差异引物中，选取扩增条带清晰、没有多余杂带、可以明显区分开的引物9对（表1）。根据表1中9对SSR引物PCR产物片段长度，选取20组多重PCR组合（表2）进行多重PCR组合和扩增条件的筛选。

20组多重PCR组合分别利用普通PCR反应条件（图1）和touch-down PCR反应条件（图2），在普通PCR条件下，扩增产物中有较多杂带;在touch-down PCR反应条件下，条带清晰，杂带较少。因此，touch-down PCR反应条件比普通PCR条件更适合作为多重PCR反应条件，同时也说明快提DNA的方法可以应用到多重PCR。根据图2所示，在touch-down PCR反应条件下，引物154、242和284没有扩增产物，引物20、118条带都不清晰。所以，在9对引物中，5对引物（20、118、154、242和284）不可以和其他引物进行组合进行多重PCR，4对引物（85、86、157和194）可以重组进行多重PCR。引物85、86、157和194分别组成了组合4（引物85、86和194）和组合10（引物86、157和194），而组合4中引物85在父母本间的条带接近，影响杂交1代杂交带读带的准确性，而组合10中引物157在杂交F1中条带清晰。最终，选择组合10在touch-down PCR反应条件下，对杂交种子进行纯度鉴定。

2.3 多重SSR标记纯度鉴定与大田纯度鉴定的对比

以组合10（引物86、157和194）为三重PCR组合，以touch-down PCR反应条件作为PCR反应条件，对192份众天10号杂交种进行纯度鉴定。图3显示，扩增产物可以明显分为3个区域，第Ⅰ区域为引物86，第Ⅱ区域为引物194，第Ⅲ区域为引物157，均为父母本杂合带型，为真杂种，由此得出众天10号甜瓜品种的纯度为100%。田间种植中，通过观察田间性状和果实性状等指标，对众天10号杂交种进行纯度鉴定，其田间纯度为100%，与多重PCR鉴定结果一致。试验结果表明，利用多重PCR和碱裂解快提DNA结合可以快速鉴定甜瓜杂种纯度。

3 讨论与结论

种子纯度是种子质量的关键因素之一，SSR分子标记纯度鉴定技术被广泛应用于许多作物的杂种纯度鉴定中[4-13]。在利用SSR分子标记鉴定杂种纯度过程中，DNA提取和PCR扩增是关键的步骤。传统的PCR反应一般加入1对引物，而杂种纯度鉴定一般需要2～3对引物才能准确鉴定出杂种的纯度，笔者利用多重PCR可以在同一PCR反应体系里加入2对及以上分子标记，能够缩短工作时间，减少试剂消耗，提高鉴定的准确性。传统的CTAB提取DNA法整个过程至少需要2 h，且试验操作复杂，笔者利用改良后的碱裂解快提DNA方法可在5 min内提取96个DNA，且不需要稀释可以直接应用于PCR扩增，大大缩短鉴定周期。

杂交种子常规SSR纯度检测流程一般包括DNA提取、PCR扩增、电泳、结果分析等4个步骤。笔者从DNA 提取和PCR扩增环节对整个过程进行了优化，而近年来通过优化PCR程序来缩短PCR扩增时间的快速PCR体系也不断应用于其他作物[17]的纯度鉴定中，快速PCR是否能与多重PCR和快提DNA结合应用于甜瓜杂种纯度鉴定，有待进一步研究。

笔者以杂交甜瓜品种众天10号及其对应亲本为材料，利用多重PCR和碱裂解快提DNA结合快速鉴定甜瓜杂种纯度，建立一套快速、准确的纯度鉴定体系，此方法不仅提高了纯度鉴定的准确性，且能够在1个工作日完成整个分子试验全部流程，大大缩短了鉴定周期，为利用分子标记进行甜瓜杂种纯度鉴定的相关研究提供了一定的参考。

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