复方板蓝根制剂中靛玉红提取工艺的研究

张前珍 李懂琴 陈国良

板蓝根和大青叶是中药复方板蓝根制剂主要成分，是我国传统的中药。板蓝根为十字花科植物菘蓝的干燥根，其主要化学成分为靛玉红和靛蓝等，有清热解毒、凉血利咽功能，用于瘟毒发斑、疗腮、喉痹、烂喉丹府、大头瘟疫、丹毒、痈肿等症，板蓝根的主要化学成分为靛玉红和靛蓝等，临床上常用于病毒性及细菌性感染疾病[1]。大青叶为十字花科菘蓝的叶，其主要化学成分为有机酸、靛蓝、靛玉红、菘蓝苷、色胺酮等化合物[2]。现代药理研究表明具有抗菌、抗癌、抗病毒、增强免疫调节作用[3]。目前，复方板蓝根制剂有颗粒剂、冲剂、糖浆剂、片剂、口服液等，对板蓝根和大青叶中有效成分靛玉红的提取，传统的提取方法是水煎煮醇沉，其有效成分损失过大，为了最大限度提取有效成分，本实验分别采用水和乙醇为溶媒，用正交试验设计法，以确定合理的提取工艺路线和最佳提取条件，靛玉红为指标进行比对，为复方板蓝根制剂的生产提供科学依据。

1 仪器和材料

1.1 试药 中药板蓝根：批号：170101；大青叶：批号：170301（产地：甘肃）。

1.2 仪器 高效液相色谱仪：U3000（Thermo Fisher美国）；电子天平：SARTORIUS CPA2250（德国，dz0.01 mg）；电热恒温水浴锅HWS-2b（上海）；KQ5200E超声清洗器（昆山）。

1.3 试剂 甲醇，色谱纯；超声重蒸馏水（自制）；乙醇，分析纯。

1.4 对照品 靛玉红（批号：110717-200204）。

2 方法和结果

2.1 靛玉红含量测定 ①条件：色谱柱：AgilentC18,ZORBAX 58- Aq（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇-水（58:42）；柱温：30 ℃；检测波长：280 mm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；时间：40 min。②对照品溶液制备：精密称取靛玉红对照品9.52 mg置50 mL量瓶中，加甲醇稀至释度，摇匀，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释度，摇匀，制成每1 mL约含2 μg的靛玉红对照品溶液。③供试品溶液的制备：精密称取以水为溶媒和以乙醇为溶媒L9（34）正交试验的清膏各1 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20 mL，精密称重，超声处理60 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。④测定靛玉红含量：精密吸取对照品溶液20 μL，再按试验号分别吸取L9（34）正交试验供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪中测定含量。

2.2 试验方法 按照复方板蓝根制剂中板蓝根和大青叶的比例，分别以水和乙醇为溶剂进行水煎煮提取和回流提取，以靛玉红作为检测指标，进行L9（34）正交试验，根据正交试验结果，进行比较、分析、验证试验和重复试验，最后得出结论。

2.2.1 水煎煮提取的正交试验 平行称取板蓝根30 g、大青叶45 g各9 份，按照L9（34）正交试验设计的因素水平表进行水煎煮提取，合并滤液，浓缩，醇沉，过滤，滤液浓缩（回收乙醇）成清膏，备用。按照2.1.4 项测定靛玉红的含量。见表1、表2。

2.2.2 乙醇回流提取的正交试验 平行称取板蓝根30 g、大青叶45 g各9 份，按照L9（34）正交试验设计的因素水平表进行回流提取，合并滤液，浓缩（回收乙醇），再醇沉，过滤，滤液浓缩（回收乙醇）成清膏，备用。按照2.1 中的第4 项测定靛玉红的含量。见表3、表4。

表1 水煎煮提取工艺正交试验因素水平表

表2 水煎煮提取工艺L9（34）正交试验结果

表3 乙醇回流提取工艺正交试验因素水平表

表4 乙醇回流提取工艺L9（34）正交试验结果

3 结 果

根据实验数据算出极差值R的大小，反映各因素对指标性成分靛玉红的影响程度。

3.1 水煎煮提取的最佳工艺 根据正交试验设计水煎煮提取板蓝根和大青叶中靛玉红，从表2中看出，因素D（温度）对提取靛玉红总量有显著性影响，因素B（次数）和因素A（时间）对提取靛玉红总量影响非常显著，因素C（水量）无显著性影响，实验结果表明水煎煮提取板蓝根和大青叶中靛玉红的最佳提取条件：D3 B2 A3 C1 即温度100 ℃、次数2 次、时间2 h、水量8 倍。对上述结果我们进行验证和重复实验，结果见表5。

表5 水煎煮提取板蓝根和大青叶中靛玉红验证试验和重复试验

3.2 乙醇回流提取的最佳工艺 根据正交试验设计乙醇回流提取板蓝根和大青叶中靛玉红，从表4 中看出，因素A（乙醇浓度）对提取靛玉红总量有显著性影响，因素B（回流时间）和因素D（乙醇用量）对提取靛玉红总量影响非常显著，因素C（回流次数）影响较小，实验结果表明乙醇回流提取板蓝根和大青叶中靛玉红的最佳提取条件：A3B2D2C2，即乙醇浓度80%、回流时间80 min、乙醇用量7 倍、回流次数2 次。对上述结果我们进行验证和重复实验，结果见表6。两种不同溶剂和提取工艺通过正交设计并进行L9（34）正交试验进行优化，对优化后的提取工艺条件进行验证和重复试验，其结果基本一致。

表6 乙醇回流提取板蓝根和大青叶中靛玉红验证试验和重复试验

3.3 两种不同溶剂和提取工艺的比对 采取两种不同溶剂和不同提取工艺，用优化的最佳工艺条件提取靛玉红，结果显示：乙醇回流法提取板蓝根和大青叶中有效成分靛玉红是水煎煮法提取靛玉红的97 倍。见表7。

表7 两种不同溶剂和提取工艺提取靛玉红总量的比对

4 讨 论

本文选择的溶剂和提取工艺理论依据，根据靛玉红的溶解性来确定。靛玉红溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚，不溶于水，微溶于乙醇，根据人用药品注册技术要求国际协调大会（ICH）制定的指导原则[4]要求，氯仿属于第二类溶剂，乙酸乙酯、丙酮、乙醚属于第三类溶剂，不能使用，所以本实验选择乙醇和水为溶剂。

目前，复方板蓝根制剂（包括片剂、颗粒剂、冲剂、糖浆剂、口服液等）大部分都是采取水煎煮醇沉提取，复方板蓝根制剂的有效成分靛玉红不溶解水，即使在煮沸时溶解很少。本实验证明，即使用正交试验优化工艺后提取的靛玉红也是很少，制剂产品质量很难控制。曾经有报道[5]用65%乙醇进行回流或渗漉提取来提高制剂产品质量。我国中医用清热解毒法在治疗温热病中地位很重要，与现代医学治疗感染性疾病应用抗菌药物为基本手段相一致，板蓝根是清热解毒中药的典型药物[6]，在抗击SARS过程中，以中国中医药研究院专家牵头的治疗小组从1000 多个中成药方中筛选出8 个有效的药物，其中有板蓝根颗粒剂。所以，研究复方板蓝根制剂有效成分提取工艺，对板蓝根的开发利用有着重要意义。