广东丝瓜醇提物抗氧化和抑制亚硝化活性

魏爱红 ，田程，庄远杯 ，刘小敏 ，李榕娣 ，张声源 *

1. 嘉应学院医学院（梅州 514031）；2. 嘉应学院医学院客家药用生物资源研究所（梅州 514031）

癌症、糖尿病、动脉粥样硬化等重大疾病都与体内过量自由基的产生有密切关联[1]。据世界卫生组织统计，全球每年约有500万人被癌症夺取生命[2]。亚硝胺是公认的最强的化学致癌物之一，能导致食管癌、胃癌等消化道病变[3]。研究显示，果蔬植物中富含的多酚类、黄酮类等物质具有抗氧化和抑制亚硝化活性[4]。从天然果蔬中寻求安全、低毒的抗氧化剂和抑制亚硝化剂越来越受广大学者的关注。

广东丝瓜（Luffa acutangula（L.）Roxb.）为葫芦科（Cucurbitaceae）丝瓜属（LuffaMill.）一年生的攀缘性草本植物[5]，其果实可作疏菜食用，为南方特色药食两用植物。广东丝瓜味甘，性平，归肺、肝、胃经，具有通经活络、解毒消肿等功效，民间常以丝瓜络、藤叶、种子及根部位入药[6]。临床常用于乳汁不通、胸胁疼痛、肺热咳嗽、痈肿疮毒、乳痈[7]。目前，对广东丝瓜的研究聚焦在品种筛选[8]、栽培技术[9]等方面，在药食两用方面的现代基础研究相对薄弱，其在抗氧化和抑制亚硝化方面的研究尚未见报道。为进一步全面比较广东丝瓜不同部位的活性作用，试验对茎、叶、种子、丝瓜络和果实5个部位乙醇提取物进行体外抗氧化及亚硝化抑制作用评价，进而为扩大广东丝瓜各个部位的药食两用及资源综合利用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

广东丝瓜采自于广东省梅州市，经嘉应学院医学院张声源副教授鉴定。样品果实、茎、叶、种子和丝瓜络5个部位晾干、粉碎，于4 ℃冰箱冷藏备用。

维生素C（VC，陇西科学股份有限公司，批号1612131）；没食子酸标准品（上海金穗生物科技有限公司，批号20160410）；2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS，阿拉丁，批号F1719012）；芦丁标准品（成都昂赛斯生物科技有限公司，批号20160815）；福林酚试剂（上海金穗生物科技有限公司，批号2016108）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海伊卡生物技术有限公司，批号STBB0829V）；氢氧化钠；硝酸铝；无水碳酸钠；对氨基苯磺酸；铁氰化钾；亚硝酸钠；三氯化铁；无水柠檬酸；二甲胺；盐酸萘乙二胺；过硫酸钾、三氯乙酸等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WJX-A1000型高速多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）；UV-1800型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；JP-100S型超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；BT125D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；UX420H型千分之一分析天平（日本岛津公司）；WA20005型电子微量天平（上海方瑞仪器有限公司）；N-1100V型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；GL-25M型离心机（上海赵迪生物科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 广东丝瓜乙醇提取物的制备

广东丝瓜不同部位（果实500.0 g 、叶250.0 g、丝瓜络250.0 g、种子150.0 g、茎250.0 g），经50 ℃烘干，粉碎，按料液比1∶2（g/mL）加入95%乙醇超声提取3次，合并提取液，减压浓缩得广东丝瓜不同部位乙醇提取物（果实7.1 g、叶9.5 g、丝瓜络6.7 g、种子5.2 g、茎6.3 g）。

1.3.2 总酚、总黄酮含量的测定

1.3.2.1 Folin-Ciocaileu比色法测总酚含量

参考李娟等[10]的方法。取1 mL没食子酸标准溶液或样品、6.0 mL蒸馏水和0.5 mL福林试剂于10 mL棕色具塞比色管中，充分摇匀避光静置2 min，加入2.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至刻度，充分混匀后在40 ℃水浴中避光放置60 min，冷却，在760 nm波长处测定其吸光度（A），以没食子酸吸光度为纵坐标Y，没食子酸质量浓度为横坐标X，绘制标准曲线：Y=7.762 5X+0.091 1，R2=0.999 1。根据标准曲线回归方程计算各样品的总酚含量，用没食子酸（Gallic acid，GA）当量表示（即每克样品中酚类化合物相当于多少毫克没食子酸mg GA/g）。

1.3.2.2 硝酸铝法测总黄酮含量

参考廉美娜等[11]的方法。精密吸取1 mL不同稀释度芦丁标准溶液或样品于25 mL棕色具塞比色管中，各加蒸馏水至7.0 mL，再加入1.0 mL 5%亚硝酸钠溶液，充分摇匀静置4 min，加入1.0 mL 10%硝酸铝溶液，充分摇匀后静置4 min，加入10.0 mL 4%氢氧化钠试液，用蒸馏水定容至25 mL，充分摇匀，静置15 min，以试液空白为参比，在500 nm处测吸光度，平行测定3次。以芦丁质量浓度为横坐标X，吸光度为纵坐标Y，绘制标准曲线：Y=13.638X-0.032 7，R2=0.999 6。根据标准曲线的回归方程计算各样品的总黄酮含量，用芦丁（Rutin，RT）当量表示（即每克样品中总黄酮类化合物相当于多少毫克芦丁mg RT/g）。

1.3.3 抗氧化活性评价

1.3.3.1 DPPH自由基的清除能力

参考景临林等[12]的方法。取1.0 mL样品或阳性对照VC溶液，和1.0 mL DPPH溶液混合，暗处静置反应20 min，以溶剂做空白对照，测定其在波长517 nm处的吸光度（Ai）；测定1.0 mL DPPH溶液与1.0 mL溶剂混合后在波长517 nm处的吸光度（A0）；测定1.0 mL溶剂与1.0 mL样品在波长517 nm处的吸光度（Aj）。按式（1）计算出样品和VC溶液对DPPH自由基的清除率。通过拟合曲线计算DPPH自由基的半数清除质量浓度IC50（IC50值越小，抗氧化活性越大）。

1.3.3.2 ABTS自由基清除能力

参考潘乔丹等[13]的方法。取100 μL样品或VC溶液于试管中，再加入3.9 mL ABTS工作液，振荡，于暗处室温反应10 min，测定其在波长734 nm处的吸光度（Ai）。同法测定3.9 mL ABTS工作液与100 μL溶剂混合后在波长734 nm处的吸光度（A0），3.9 mL磷酸缓冲溶液与100 μL样品在波长734 nm处的吸光度（Aj）。按式（1）计算出样品和VC溶液对ABTS自由基的清除率。通过拟合曲线计算ABTS自由基的半数清除质量浓度IC50（IC50值越小，抗氧化活性越大）。

1.3.3.3 铁还原能力的测定

参考李培源等[14]的方法。取2.5 mL样品、2.5 mL pH 6.6的PBS缓冲液和2.5 mL K3[Fe(CN)6]溶液于10 mL试管中，摇匀后在50 ℃下恒温水浴反应20 min，急速冷却，加入2.5 mL三氯乙酸溶液，充分摇匀后转移到10 mL离心管中，在6 000 r/min下离心10 min，取2.5 mL上清液于试管中，依次加入2.0 mL蒸馏水与0.5 mL FeCl3溶液，混合均匀，静置10 min后于700 nm测定吸光度。以VC溶液为阳性对照重复上述操作。

1.3.4 抑制亚硝化作用评价

参考林栋等[4]的方法。取1.0 mL样品、2.0 mL pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和2.0 mL亚硝酸钠溶液于比色管中，混匀。在37 ℃下水浴1 h，取出，加入2.0 mL 0.4%对氨基苯磺酸，混匀，静置5 min后，加入1.0 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加蒸馏水至刻度，混匀，静置15 min后在538 nm下测定吸光度，同时用VC进行对照试验。按式（2）计算出样品和VC溶液对亚硝酸盐的清除率。

式中：A0为空白反应体系的吸光度；Ai为样品反应体系的吸光度。

1.4 数据处理

各试验重复3次，结果以“平均值±标准差”表示，采用Origin 2017对数据进行绘图，利用IBM SPSS Statistics 25对数据进行单因素方差分析、Duncan检验差异显著性分析以及Pearson检验相关性分析，p＜0.05表示有统计学显著性差异，p＜0.01表示有统计学极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 广东丝瓜不同部位总酚、总黄酮的含量对比

由表1可知，广东丝瓜不同部位的总酚和总黄酮含量差异显著（p＜0.05）。总酚含量大小依次为果实＞茎＞叶＞种子＞丝瓜络。总黄酮含量大小依次为茎＞种子＞叶＞丝瓜络＞果实。

表1 广东丝瓜不同部位总酚、总黄酮含量

2.2 抗氧化活性评价

2.2.1 DPPH自由基的清除能力

由图1可知，广东丝瓜不同部位乙醇提取物对DPPH自由基的清除率呈量效关系，大小为茎＞叶＞丝瓜络＞果实＞种子。对DPPH自由基清除率的IC50分别为茎（0.84±0.13 mg·mL-1）、叶（1.09±0.12 mg·mL-1）、丝瓜络（1.31±0.56 mg·mL-1）、果实（1.58±0.42 mg·mL-1）、种子（1.64±0.36 mg·mL-1），均高于VC的0.003 2±0.000 2 mg·mL-1。说明广东丝瓜5个部位乙醇提取物均具有清除DPPH自由基能力，但均弱于VC。

图1 广东丝瓜不同部位对DPPH自由基清除能力

2.2.2 ABTS自由基的清除能力

由图2可知，广东丝瓜不同部位乙醇提取物对ABTS自由基的清除率呈量效关系，大小为茎＞果实＞丝瓜络＞叶＞种子。对ABTS自由基清除率的IC50分别为茎（2.55±0.09 mg·mL-1）、果实（3.22±0.17 mg·mL-1）、丝瓜络（4.38±0.78 mg·mL-1）、叶（5.98±0.32 mg·mL-1）、种子（7.55±0.96 mg·mL-1），均高于VC的0.027±0.000 3 mg·mL-1。说明广东丝瓜5个部位乙醇提取物均具有清除ABTS自由基能力，但均弱于VC。

图2 广东丝瓜不同部位对ABTS自由基清除能力

2.2.3 铁还原能力的测定

由图3可知，当质量浓度为0.5～8 mg·mL-1时，随质量浓度增加，吸光度逐渐增大，说明铁还原能力逐渐增大，铁还原能力大小依次为果实＞茎＞种子＞丝瓜络＞叶，但弱于VC。

图3 广东丝瓜不同部位对铁还原能力的影响

2.3 抑制亚硝化作用评价

由图4可知，广东丝瓜不同部位乙醇提取物对亚硝酸盐清除率呈量效关系，大小为果实＞种子＞叶＞丝瓜络＞茎。对亚硝酸盐清除率的IC50分别为果实（11.38±1.56 mg·mL-1）、种子（11.82±1.78 mg·mL-1）、叶（13.10±0.49 mg·mL-1）、丝瓜络（16.22±2.58 mg·mL-1）、茎（57.24±2.12 mg·mL-1），均高于VC的2.909±0.242 mg·mL-1。说明广东丝瓜5个部位乙醇提取物均具有清除亚硝酸盐能力，但均显著弱于VC。

图4 广东丝瓜不同部位对亚硝酸盐清除能力的影响

2.4 总酚、总黄酮含量与抗氧化和抑制亚硝化能力的相关性分析

由表2可知，广东丝瓜乙醇提取物中总酚、总黄酮含量与DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、铁还原能力、亚硝酸盐清除能力呈极显著正相关。总酚含量与DPPH自由基清除、铁还原能力、亚硝酸盐清除的相关性高于总黄酮，总黄酮含量与ABTS自由基清除能力相关性高于总酚。

表2 相关性分析结果

3 讨论与结论

广东丝瓜在民间具有食用基础和药用习惯，但鲜有关于其抗氧化和抑制亚硝化作用的药理、药效方面的研究。此试验通过测定广东丝瓜不同部位乙醇提取物中总酚和总黄酮的含量，评价其抗氧化和抑制亚硝化活性。广东丝瓜不同部位总黄酮和总酚含量不同，其原因可能是植物不同部位基因的特异表达转录和植物在生长发育过程中各器官起到不同作用，产生不同的生理代谢，从而使不同部位的代谢物含量存在明显的差异[15-16]。广东丝瓜茎提取物清除DPPH自由基能力和ABTS自由基能力最强，果实提取物对铁还原能力清除亚硝酸盐能力最强。表明茎和果实可作为一种潜在抗氧化和抑制亚硝化作用的功能性食品原料进行开发利用。此外，广东丝瓜5个部位乙醇提取物的抗氧化活性和抑制亚硝化活性与其总酚和总黄酮含量均呈极显著正相关（p＜0.01），提示寻找广东丝瓜的抗氧化和抑制亚硝化活性成分应从酚类或黄酮类成分着手。目前，关于植物源抗氧化和抑制亚硝化活性成分筛选的研究较多，而对其构效关系、作用机制、成分间的协同或拮抗作用等研究仍缺乏系统性，尚未形成规律性的科学依据和结论[17]。为此，后续研究中应加大对广东丝瓜中酚类和黄酮类成分种类、结构、抗氧化、抑制亚硝化活性作用机制及构效关系等方面的系统研究。