气相色谱-质谱联用法测定食品中9种胆固醇氧化物

杨俊，吴轩民，侯璐，张协光，李忠，卢灿鑫

1. 深圳市计量质量检测研究院，国家营养食品质量监督检验中心（广东）（深圳 518109）；2. 南京医科大学公共卫生学院（南京 211166）

胆固醇氧化物（Cholesterol Oxidation Products，COPs）是胆固醇的氧化产物，普遍存在于肉制品、乳制品、蛋制品和动物脂肪中[1]。在食品制作工艺流程和处理过程中，胆固醇通过光、氧及高温等作用容易发生自身氧化反应，进而衍生成胆固醇氧化产物[2]。胆固醇氧化物对健康存在一定损害，医学研究已指出胆固醇氧化物与人体动脉硬化[3]、基因突变[4]以及致癌[5]有直接关系。

目前，胆固醇氧化物的检测方法有气相色谱法[6]、高效液相色谱法[7]、液相色谱-质谱联用法[8]以及气相色谱-质谱联用法[9]等。气相色谱-质谱联用法结合了气相色谱和质谱的优点，其利用毛细管柱和单重四极杆检测器，可以克服基质干扰，有更好的分辨率、更高的灵敏度，具有很强的定性定量能力[10]。

此次试验依据传统Folch提取法[11]，并作了一定改进；探讨了固相萃取柱对试验结果的影响，优化了气相色谱-质谱联用仪的分离条件。同时，为了避免提取过程中可能会出现待测物的损失，影响试验结果，选择19-羟基胆固醇作为试验的内标物[12]，以提高试验结果的准确性。以市面上的常见动物源性的食品如鱼肉、猪肉和牛肉为研究对象，对其COPs含量进行检测。分析新鲜肉制品和腌制处理过的肉制品中9种胆固醇氧化物含量差异情况，为食品中胆固醇氧化物检测的提供了技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-5977B气相质谱仪（美国Agilent公司）；全自动氮吹仪（上海安谱 EFAA-DC24）；超声仪（予皓 YH-200DH）；Milli-Q Reference超纯水系统（法国 Millipore）；电子天平（万分之一，中国赛多利斯）；旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；SPE硅胶柱/氨基柱（500 mg/3 mL，美国Supelco公司）。

5β，6β-环氧化胆固醇（99%）、7α-羟基胆固醇（98%）、20α-羟基胆固醇（97%）、7β-羟基胆固醇（96.7%）、5α，6α-环胆固醇氧化物（92%）、3β，5α，6β-胆甾烷三醇（97%）、25-羟基胆固醇（98%）、7-酮基胆固醇（98%）、27-羟基胆固醇（97%）、19-羟基胆固醇（98%）：TRC公司；N, O-双（三甲基硅烷）三氟乙酞胺（BSTFA，含1%三甲基氯硅烷，Sigma-Aldrich公司）；三氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、乙醚、丙酮（色谱纯，Merck公司）；实验室用水（超纯水）。试验中的鱼肉、猪肉和牛肉等样品（市售）。

1.2 试验方法

1.2.1 气相色谱条件

色谱柱，DB-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温升温程序，初始温度150 ℃（保持2 min）→20℃/min升温至300 ℃（保持20 min）；进样口温度，280 ℃；进样模式，不分流；进样量，1.0 μL；载气，氦气（He，纯度＞99.999%）。

1.2.2 质谱条件

离子源温度，230 ℃；四极杆温度，150 ℃；传输线温度，250 ℃；电离方式，电子轰击（EI）离子源；电子能量，70 eV；电子倍增器电压，1 632 V；采集模式，离子扫描模式（SIM）；扫描质量范围，m/z50～550；溶剂延迟，8 min。

1.2.3 标准溶液配制

分别称取0.005 0 g 10种胆固醇氧化物标准品，使用色谱纯的正己烷定容至5.00 mL，超声混合均匀，配制质量浓度为1.0 mg/mL的胆固醇氧化物标准品的储备液。用正己烷逐级稀释标准品储备液，得到0.2，0.5，1.0，5.0和10.0 μg/mL混合标准品工作液，并且使得系列工作液中19-羟基胆固醇内标物的质量浓度均为0.2 μg/mL，放置于棕色瓶中。于4 ℃避光保存，保存期为1个月。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品脂类提取

准确称取2.0 g均质粉碎的样品于三角瓶中，加入2 μg 19-羟基胆固醇作为内标物。加入150 mL三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）提取剂，充分振荡2 min，然后超声30 min；置于4 ℃环境中过夜，静置分层，再用滤纸过滤，获得滤液，氮气吹干，得到脂类物质。

1.3.2 皂化

向1.3.1小节中得到的脂类提取物中加入10 mL 1 mol/L KOH溶液和10 mL甲醇，充分振荡，超声5 min，使样品混合。室温下静置皂化10 h，然后用10 mL去离子水转移至分液漏斗中，用10 mL乙酸乙酯重复萃取3次。移取上层溶液，再用10 mL去离子水冲洗萃取液。用无水硫酸钠过滤除水，获得滤液，在旋转蒸发仪上浓缩至近干。

1.3.3 净化浓缩

向1.3.2小节中得到的皂化后的提取物中加入3 mL正己烷，充分振荡溶解，然后缓慢加入到已活化的NH2-SPE中，依次用10 mL正己烷-乙酸乙酯（95∶5，V/V）、10 mL正己烷-乙酸乙酯（90∶10，V/V）洗柱，弃掉废液，最后用5 mL丙酮洗柱，收集滤液，氮气吹干。

1.3.4 衍生化

加入100 μL N, O-双（三甲基硅烷）三氟乙酰胺BSTFA衍生试剂，在60 ℃下衍生40 min，衍生结束后，用氮气吹干，用1.0 mL正己烷溶解，上机测试。

2 结果与分析

2.1 固相萃取柱的选择

固相萃取是利用柱填料对不同极性物质的选择性吸附与选择性洗脱，从而实现样品的净化和浓缩。在提取的脂质中，胆固醇脂类和三油甘脂极性最弱，磷脂类极性最强，而胆固醇和胆固醇氧化物具有中等极性[13]。因此，可以选择极性的固相萃取柱，再用不同组分的极性溶剂洗脱，从而实现净化和浓缩COPs。

此次试验选取2种常见的固相萃取柱（NH2-SPE和Si-SPE），先用5 mL正己烷活化，加入样品后，按照图1的洗脱步骤，探讨不同固相萃取柱对试验结果的影响。结果表明，使用NH2-SPE具有更高的回收率（见图2），因此试验选择NH2-SPE进行净化浓缩操作。

图1 不同SPE洗脱步骤示意图

图2 不同SPE类型的影响

2.2 色谱分离条件的优化

考虑到COPs结构相近，具有中等极性，试验选择非极性柱DB-5ms毛细管色谱柱，并对10种COPs的色谱分离条件进行优化。最终确定的柱温箱升温程序为：初始柱温箱温度150 ℃（保持2 min）→20 ℃/min升温至300 ℃（保持20 min）。按照柱温箱的优化条件，确定质谱端选择电子轰击离子源，能量设置为70 eV，电子倍增器电压设置为1 632 V；采集模式为SIM模式，扫描质量范围为m/z50～550。气相色谱-质谱总离子流图如图3所示，在最佳的色谱分离条件下，10种COPs在24 min内能实现基线分离，分离效果良好；并且19-羟基胆固醇保留时间为16.8 min，位于保留时间中前段，与其他9种COPs没有干扰，结果表明19-羟基胆固醇可以作为此次试验的内标物。

2.3 方法学评价

2.3.1 标准曲线与检出限

取胆固醇氧化物系列混合标准品工作液，按1.3.4小节进行衍生化反应，利用已建立的色谱分离条件，进行测定分析。以9种COPs的定量离子峰面积与19-羟基胆固醇的定量离子峰面积的比值作Y轴，以9种COPs工作液浓度与19-羟基胆固醇浓度的比值作X轴，绘制标准曲线，进行线性回归，计算即可得到9种胆固醇氧化物的含量。如表1所示，在0.2～10 μg/mL线性范围内，9种COPs的相关系数均大于0.998，方法检出限低于0.000 15 mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度

选取新鲜鱼肉、猪肉和牛肉等样品，分别均质粉碎，作为空白样品。添加高、中、低3个水平浓度的COPs系列混合标准品工作液，按照1.3小节处理，进行加标回收率测定，每个加标水平平行测定3次（n=3）。如表2所示，9种COPs的加标回收率在79.6%～101%之间，其相对标准偏差（RSD）低于5%，表明该方法满足鱼肉、猪肉和牛肉等样品中9种COPs含量的分析检测。

图3 10种COPs混合标准溶液（0.2 μg/mL）的气相色谱-质谱总离子流色谱图

表1 9种COPs的检出限、线性范围、回归方程和相关系数（R2）

表2 空白样品中9种COPs的回收率和精密度（n=3）

接表2

2.3.3 实际样品的检测

从市场上选取新鲜鱼肉、新鲜猪肉、新鲜牛肉、腌制鱼肉、腌制猪肉、腌制牛肉作为试验样品，利用所建立的分析方法检测COPs含量，每个样品平行测定两次，取平均值，结果如表3所示。新鲜鱼肉、猪肉和牛肉中COPs总量为未检出，而腌制鱼肉中COPs总量为4.55 mg/kg；腌制猪肉中COPs总量为5.91 mg/kg；腌制牛肉中COPs总量为6.43 mg/kg。腌制过的肉类食品中COPs含量显著高于新鲜的同类食品，这表明在食品腌制处理过程中，胆固醇氧化产物在光、氧等作用下反应产生。

表3 肉类样品中9种COPs的含量（n=2）

3 结论

此次试验建立了气相色谱-质谱测定食品中9种COPs含量的检测方法。采用19-羟基胆固醇作为内标物，以提高检测方法的准确性。改进了前处理方法，优化了皂化条件、固相萃取柱以及气相色谱/质谱联用仪的分离条件，该方法的线性范围、检出限、回收率和精密度均能够满足实际样品的检测要求。通过对市售食品中COPs的测定，结果发现腌制过的肉类食品中COPs含量显著高于新鲜的同类食品。此次试验为食品中胆固醇氧化物的检测提供技术支持。