海参胶原蛋白的提取及其活性研究

叶加兰，吕道飞，周坪骏，许锋，颜健，袁文兵，陈忻

（佛山科学技术学院 环境与化学工程学院，广东佛山 528000）

海参属于棘皮动物门海参纲无脊椎动物，全球有900多种，我国约有140种，其中印度洋、西太平洋海区是世界上海参种类最多、资源量最大的区域。海参的体内含有蛋白质、脂肪、维生素、胶质、海参皂甙、多种微量元素和酸性黏多糖等成分，且不含有胆固醇[1-2]。

海参胶原蛋白是海参体内含量最为丰富的活性成分，是多种海参蛋白中的主体。胶原蛋白是由多糖蛋白分子组成的独特结构，这种独特结构使其具有合成高分子不具备的生物降解性、生物相容性和低抗原性，具有保护内皮细胞、抑制血管紧张素转化酶（ACE）活性、少黑色素生成、提高记忆力和抗疲劳等一系列重要的生物学功能[3]。

1 海参胶原蛋白的提取

从海参中提取胶原蛋白及其水解物的方法有酶法、酸法、碱法、酶与碱结合以及酶与酸结合等方法。酸解法通常需要用0.1 mol/L醋酸长时间浸泡海参，并且海参的溶解量较少。蛋白酶水解胶原的优势主要是所需设备简单、条件温和、反应速率快，提取的胶原蛋白水溶性好、理化性质稳定、纯度高等，所以酶解法制备海参胶原蛋白更为常见[4]。

任婷婷等[5]以酶解法制备海参胶原蛋白肽并优化了制备工艺条件。以海参体壁作为实验原料，在单因素试验的基础上，采用响应面分析对酶解工艺条件进行优化。实验结果表明，以木瓜蛋白酶为水解酶，添加底物浓度5.5%、酶解温度控制67.8 ℃、pH值6.7、酶添加量2 500 U/g、控制酶解时间为4 h，在此条件下，海参胶原蛋白肽的水解度为17.76%，所得海参胶原蛋白肽的制备工艺条件最佳。

陈卉卉等[6]以东海海参为原料，选取木瓜蛋白酶、风味蛋白酶以及复合酶（木瓜-风味）提取海参胶原蛋白，以自由基清除率为指标，在其最佳水解条件下水解，确定了海参蛋白多肽清除自由基最优条件是使用木瓜蛋白酶水解4 h，清除率可达70%以上；多肽清除超氧自由基及羟自由基的IC50分别为49.3 mg/mL和27.8 mg/mL。

梁杰等[7]以海参为原料制备海参蛋白多肽，以水解度和羟自由基清除率为指标，从木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶中筛选出最适酶。确定以碱性蛋白酶制备海参蛋白多肽水解度明显高于其他蛋白酶，酶添加量4%，酶解时间3.0 h，酶解温度55 ℃，pH值8.0为最佳工艺条件，通过最优工艺参数验证实验，得到羟基自由基清除率为63.75%。

高杨[8]通过均匀实验确定了海参体壁酸溶性胶原蛋白提取的最佳条件为料液比1∶1 000（g/mL）、乙酸浓度0.5 mol/L、提取时间72 h，在此条件下得率为7.35%。通过红外吸收光谱以及紫外吸收光谱谱图鉴定可知，所提取的海参体壁酸溶性胶原蛋白纯度较高，保持着完整的三股螺旋构型；通过氨基酸分析可知其氨基酸组成类似于Ⅰ型胶原。

2 海参蛋白的生物活性

海参胶原蛋白不仅具有美容养颜、延缓衰老、增强免疫力、改善记忆等胶原蛋白常见功效，其富含的海参多糖、海参皂甙等营养成分也有益于人体健康，与组织的形成、成熟、细胞间的信息传递有着密切的关系。

赵芹等[9]表明，冰岛刺参胶原蛋白多肽对经过H2O2诱导的神经细胞的损伤具有显著保护作用，其中低分子量的蛋白多肽的效果更佳。研究中采用H2O2诱导高分化PC12细胞建立氧化损伤神经细胞模型，将细胞分成正常对照组、模型对照组（H2O2）和样品保护组（胶原蛋白多肽+H2O2），先采用冰岛刺参胶原蛋白多肽C1和C2处理细胞后，加入H2O2损伤细胞。分别以甲基偶氮唑盐（MTT）法测定PC12细胞的增殖活性，采用试剂盒检测细胞内活性氧水平、丙二醛含量、细胞内抗氧化酶和Caspase-3的活性及培养基中乳酸脱氢酶的释放量。当剂量大于50 μg/mL时，C1和C2均可显著提高由H2O2诱导损伤的PC12的增殖活性。高剂量组的细胞中活性氧水平均显著降低，中、高剂量组细胞的乳酸脱氢酶释放量和丙二醛活力均显著升高，各组细胞凋亡因子Caspase-3的活性显著下降。

宋佳佳等[10]以海参为原料，以羟自由基（·OH）清除能力、Fe2+螯合能力和Fe3+还原能力为指标，在试验中以H2O2刺激RAW264.7巨噬细胞建立氧化损伤细胞模型，研究其蛋白肽的体外抗氧化活性和对H2O2诱导RAW264.7巨噬细胞氧化损伤的保护效果和作用机制。实验结果表明，海参蛋白肽能够清除·OH自由基，具有Fe3+还原能力和Fe2+螯合能力，且其体外抗氧化能力呈现出浓度依赖效应。海参蛋白肽能提高氧化损伤细胞活力，也可以显著降低氧化损伤RAW264.7巨噬细胞活性氧水平，显著提高巨噬细胞内血红素氧合酶-1的mRNA表达。实验结果说明，海参蛋白肽是通过上调RAW264.7巨噬细胞内血红素氧合酶-1的mRNA的表达水平发挥对巨噬细胞氧化损伤的保护作用。

赵芹等[11]采用氧化型低密度脂蛋白处理血管内皮细胞建立氧化应激损伤模型，观察北极刺参胶原蛋白多肽及革皮氏海参这两种蛋白肽对氧化型低密度脂蛋白损伤的血管内皮胞的保护作用，结果表明经由2种海参胶原蛋白多肽预处理后，血管内皮细胞的增殖率、细胞一氧化氮合酶活力和NO释放量均显著升高，细胞凋亡比率、丙二醛含量显著降低和凋亡蛋白Caspase-3的表达量均显著降低。可见，2种海参胶原蛋白多肽对经脂质过氧化物损伤的血管内皮细胞均有保护能力。

3 结语

近年来，海参养殖业在我国蓬勃的发展，其营养成分和活性功效备受专家学者的关注。海参中的活性物质有脂肪、维生素、胶质、蛋白质、海参皂甙、多种微量元素和酸性黏多糖等成分，其中蛋白质含量最为丰富，蛋白质中又以胶原蛋白为主。海参胶原蛋白除了具有美容养颜、延缓衰老、增强免疫力、改善记忆等胶原蛋白常见功效，其蛋白肽小分子对人体损伤细胞还具有显著的保护作用。