OS细胞lncRNA MT1JP增强miR-646下调FGF2表达的分子机制研究

肖 森，杨 磊，刘 超*，王晓菲，王永军

（ 1.寿光市中医医院骨伤二科，山东 寿光 262700；2.中国人民解放军第八九医院创伤三科，山东 潍坊 261021；3.寿光市人民医院东城医院心内呼吸科，山东 寿光 262700）

骨肉瘤(Osteosaroma，OS)是一种来源于间质细胞的恶性肿瘤,主要影响青壮年和儿童,全世界发病率为3.4-4.3‰，其病情进展快、恶变性高[1]。OS无转移患者确诊后，即使经过积极的治疗，如辅助或新辅助化疗、肿瘤切除和放射治疗，其5年生存率可大于65%。OS转移患者的死亡率为3.4‰～4.3‰，5年生存率小于65%[2]。因此，要提高OS患者的生存率，需要一种能早期诊断的生物标志物和新的治疗方法。

OS的遗传学研究已经确认可作为OS治疗靶点的候选基因。非编码长链RNA(LncRNAs)在包括肿瘤发生在内的多类生物学活动中起关键调节作用，LncRNAs能调节下游多种肿瘤相关因子的表达，从而抑制或加速OS病情的进展。已有报道证实LncRNA MT1JP在肝、肺等多个脏器肿瘤发育过程中发挥抑制作用，但其确切机制尚不清楚。已知MT1JP、miR-646与p53信号通路有交联，MT1JP可能与miR-646存在间接相互作用[3]。MIR-646主要通过下调癌基因来抑制肿瘤的发展和进展[4]，在OS中，miR-646直接靶向作用FGF2，负向调控其表达，减弱肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力，并促进肿瘤细胞凋亡[5]。本研究探讨了MT1JP、miR-646和FOXK1在OS中的相互作用。

1 研究对象

选取我院2015年6月至2018年9月收治的OS患者42例(男性23例，女性19例，年龄18-39岁，30.1±5.5岁)。纳入标准如下：(1)新确诊病例；(2)入院前未接受治疗；(3)AJCC I期(n=19)或II期(n=23)。排除标准如下：(1)复发的OS患者；(2)外院转入的OS患者； (3) 患有心脑肾等重大基础疾病，如高血压病、冠心病、器官功能障碍等。在同一时期，该研究还招募了42名健康志愿者(男性23名，女性19名，年龄18-38岁，30.3±5.3岁)作为对照组。所有参与者都被告知了实验原理，都签署了知情同意书。这项研究通过了本院伦理委员会的审查。

2 样 本

所有OS患者均行组织病理学检查。OS(骨肉瘤组织)及OS旁非肿瘤组织(0.05～0.09g)均取自OS患者。治疗前对OS患者和健康志愿者空腹采血(4～5mL)，用含有EDTA的试管采集血液，然后在室温下离心15min，获取血浆。

3 细胞培养与转染

U2OS(ATCC)人OS细胞在体外实验中用含10%胎牛血清(FBS)的培养液，37℃，5%CO2条件下培养。MT1JP和FGF2的表达载体(pcDNA3载体)。miRNA-646模拟物(5’-AAGCAGCUGCCUCUGAGGC-3’)和阴性对照miRNA(5’-CUAGUCAUCGAUGUCGUAGCA-3’)。用10 nM MT1JP或FGF2表达载体、脂质体2000模拟的35nM miR-646转染U2OS细胞(2x105细胞)。以U6为内源性对照，检测miR-646的表达水平。

蛋白质印迹分析：采用RIPA溶液提取细胞总蛋白，提取比例为105个细胞/1mL溶液。各组细胞转染后培育48小时，使用标准方法进行蛋白质印迹分析。通过10%SDSPAGE分离蛋白质，然后转加入PVDF膜，经5%的BSA封闭1h后加入抗FGF2一抗，4℃过夜孵育，再加入酶标二抗，室温孵育1.5h，加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照，并统计灰度值计算相对表达量。

本文给出的统计分析值均为平均值,通过三组样本重复测量数据计算得来。用配对T检验分析两种组织间的差异。采用非配对t检验探讨OS患者与健康人之间的差异。相关性采用线性回归分析。采用ROC曲线分析进行诊断分析。P＜0.05有统计学意义。

4 结 果

OS组织、正常组织中MT1JP表达下调。用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测OS组织、正常组织和血浆中MT1JP的表达。用配对t检验分析MT1JP在OS和非肿瘤组织中表达水平的差异。MT1JP在OS组织中的表达水平明显低于非肿瘤组织，采用非配对t检验探讨OS患者与对照组血浆MT1JP水平的差异，发现OS患者血浆MT1JP水平明显低于对照组(图1，P＜0.05)。

血浆MT1JP水平变化能将早期OS患者同健康人区分开。为了评价血浆MT1JP对早期OS的诊断价值，生存分析仅包含Ⅰ、Ⅱ期OS患者。ROC曲线分析中，健康对照组(n=42)为阴性，OS患者(n=42)为阳性(图2)。观察到曲线下面积(AUC)为0.884(AUC＞0.65提示有诊断依据)。

MT1JP可通过上调miR-646，进而下调FGF2的表达。将MT1JP表达载体、miR-646模拟载体和FGF2载体转染U2OS细胞。蛋白质印迹分析显示MT1JP或miR-646过度表达导致FGF2表达下调(图3)。

5 讨 论

本研究探讨MT1JP在OS中的作用及临床价值，MT1JP在OS中表达下调，MT1JP过度表达可通过上调MIR-646的表达，进而下调FGF2，从而抑制OS细胞的侵袭和迁移，而miR-646可以直接靶向作用于FGF2。OS患者的治疗结果易受临床分期的影响，晚期OS患者治愈率低。因此，早期诊断对OS患者后期的治疗效果有显著影响。MT1JP在多种类型的癌症中表达下调，并发挥着肿瘤抑制作用。在本次实验中，OS患者和健康对照组血浆中均检测到MT1JP，我们发现MT1JP在OS组织及血浆中低表达。MT1JP血浆中的低水平表达可将早期OS患者与健康对照组区分开来。因此，血浆MT1JP可用于临床辅助OS的早期诊断。但其特异性和敏感性有待进一步检验。miR-646主要通过下调癌基因(如FOXK1和EGFR)来抑制肿瘤的发生和发展。相关研究报道miR646调节OS细胞的增殖，而初步研究表明MT1JP对细胞增殖没有明显的影响。这可能是由于所使用的细胞系不同所致，亦有可能是MT1JP可能与多种因素相互作用，以达到对OS细胞不同行为的精细调控。

6 结 论

MT1JP在OS中表达下调，血浆中循环MT1JP表达下调可作为OS的早期诊断指标。MT1JP可能通过miR-646下调FGF2的表达，从而抑制OS细胞的迁移和侵袭。血浆中MT1JP水平的下调可作为OS的早期诊断指标。因此，MT1JP有可能成为OS的早期诊断指标和治疗靶点。