芍药苷对Bayk8644诱导大鼠抑郁焦虑样行为的改善作用及机制研究

李 萍，李艺杰，薛 玲，宋春红

（1. 青岛大学附属医院药学部，青岛 266001；2. 北京唯新唯实教育科技有限公司，北京102200；3. 山东中医药大学，教育部中医药经典理论研究重点实验室， 济南250355)

芍药苷（paeoniflorin）是中药白芍和赤芍的主要有效单体成分。近年来，芍药苷对神经系统的药理作用受到越来越多研究者的关注，其神经保护机制可能与多个受体和离子通道有关[1]。本课题组前期研究[2]发现，芍药苷可能通过调控L型电压依赖型钙通道（L-type voltage-dependent calcium channel，LTCC）显著改善经前烦躁障碍症（premenstrual dysphoric disorder，PMDD）肝气郁结大鼠的抑郁情绪，但具体作用机制尚待进一步探明。为解析芍药苷与LTCC的关系，本研究利用LTCC激动剂Bayk8644为工具药[3]，采用行为学和蛋白质印迹技术检测芍药苷对LTCC开放后大鼠行为学以及LTCC下游钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ，CaMKⅡ）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factors，BDNF）表达的影响，以期揭示芍药苷的药理作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠48只，体质量（130±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2016-0006]。昼夜颠倒适应性饲养1周，饲养室温度（21±1）℃，相对湿度55%±5%，大鼠自由进食饮水[SYXK（鲁）2017-0022]。实验操作在暗淡的红灯（＜25 lux）下进行，对动物的操作遵遁我国相关法规。本研究通过山东中医药大学动物伦理委员会审核批准（SDUTCM20190727001）

1.2 药物与试剂

Bayk8644（L型钙通道激动剂）（B112-5MG）和二甲基亚砜（DMSO）（D2650-5X5ML）均购自美国Sigma公司；芍药苷（GR-133-161209）购自南京广润生物制品有限公司；尼莫地平（Nimodipine）（N7634-1G）购自美国Sigma公司；PVDF膜（Ipvh00010）和ECL发光液（P90720）均购自美国Millipore公司；CaMKⅡ抗体（Ab134041）、pho-CaMKⅡ抗体（Ab171095）和BDNF抗体（Ab108319）均购自英国Abcam公司；β-actin（TA-09）、羊抗兔二抗（ZB-2301）和羊抗小鼠二抗（ZB-2305）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；蛋白Marker（26616）、Cocktail（78441-1）、RIPA（R0010）、BCA 试剂盒（PC0020）和SDS-PAGE试剂盒（P1200-1/P1200-2）均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器设备

实验动物行为分析系统为美国Panlab公司产品；实验动物行为视频采集分析系统、大鼠高架十字迷宫和旷场实验箱为上海欣软信息科技有限公司产品；全波长酶标仪（Synergy H1）为美国BioTek公司产品；化学发光凝胶成像仪（BOXChemiXR5）为英国Syngene公司产品。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与给药 大鼠适应性饲养期间，每隔1 d适应含糖饮水（含0.8%蔗糖）1h。适应饲养结束后，灌胃给药操作开始前，单笼饲养，禁食禁水24 h，进行旷场实验和糖水偏好实验。根据糖水与旷场实验基线数据将大鼠平行分为6组，每组8只，分别为正常组、Bayk8644（0.2 mg·kg-1·d-1）组、芍药苷高剂量（200mg·kg-1·d-1）组、芍药苷中剂量（100mg·kg-1·d-1）组和芍药苷低剂量（50 mg·kg-1·d-1）组，以及阳性对照药物尼莫地平（1mg·kg-1·d-1）组。各组大鼠给药量为10 mL·kg-1·d-1，尼莫地平组、正常组和Bayk8644组每日相同时间给予相同剂量蒸馏水，连续给药1周。尼莫地平组腹腔注射尼莫地平。10min后除正常组，其余各组均腹腔注射Bayk8644。10 min后进行旷场实验（open field test）以及高架十字迷宫实验。行为学实验结束即用断头器断头处死大鼠，冰上分离出海马体，－80℃冰箱备用。

1.4.2 旷场实验 旷场实验时间都在8∶30 am ～12∶00 am进行。利用SuperMaze动物行为视频跟踪系统分析数据。旷场实验时间为6 min，摄像采样速度为15帧/s。检测指标为运动总路程、中央区路程、中央区停留时间和直立次数。

1.4.3 高架十字迷宫实验 将大鼠放置于高架十字迷宫中心交叉点处，头部朝向开放臂，利用SuperMaze软件记录大鼠5 min自由活动状态的运动轨迹。分析大鼠运动总路程、平均速度、进入开放臂时间（time in open arm，OT）、进入封闭臂时间（time in close arm， CT）、进入开放臂次数（open arm entry，OE）和进入封闭臂次数（close arm entry，CE）。计算进入开放臂时间百分比[OE%= OE/（OE+CE）×100%]和进入次数百分比[OT%= OT/（OT+CT）×100%]。

1.4.4 蛋白质印迹检测 脑组织称重后按照1∶7的比例加入RIPA裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）并研磨。4℃16110×g离心10 min后取上清液，加入5×上样缓冲液，100℃水浴变性5～10 min，BCA试剂盒检测蛋白浓度，分装后－20 ℃保存。每泳道上样40 µg总蛋白，将PAGE胶湿法转移至PVDF膜上，剪下相应蛋白条带，TBST洗膜后加入相应一抗（pho-CaMKⅡ1∶1 000，BDNF 1∶5 000），4 ℃振荡孵育过夜。TBST洗膜后加入二抗（1∶10 000）室温振摇1h。TBST洗膜（3次，10 min/次），TBS洗膜10 min。取出并吸去PVDF膜的TBS ，滴加ECL发光液成像。

1.5 统计分析方法

使用GraphPad Prism 6 软件（GraphPad Software, Inc.，San Diego，California，USA）统计数据，采用单因素方差分析处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 旷场实验

与正常组大鼠相比，Bayk8644组旷场实验运动总路程、中央区总路程和中央区停留时间明显缩短，直立次数显著减少（P＜0.01或P＜0.05）；芍药苷组与正常组大鼠无明显差异。与Bayk8644组相比，芍药苷高剂量组旷场总路程、中央区总路程、中央区停留时间和直立次数各指标明显升高（P＜0.01或P＜0.05），芍药苷中剂量组旷场总路程、中央区停留时间和直立次数各指标明显升高（P＜0.05），芍药苷低剂量组中央区停留时间明显延长（P＜0.05）。尼莫地平组与Bayk8644组相比，各指标有升高趋势，但差异无统计学意义（图1）。旷场轨迹图见图2。

2.2 高架十字迷宫实验

高架十字迷宫结果显示（图3），注射Bayk8644后大鼠OE%、OT%、活动总路程和平均速度各指标与正常组相比明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；与Bayk8644组相比，芍药苷高剂量组的OE%、OT%、活动总路程和平均速度各指标明显升高（P＜0.05或P＜0.01），芍药苷中剂量组的OT%明显升高（P＜0.05）；芍药苷各组各指标与正常组无明显差异。尼莫地平组各指标与Bayk8644组相比有升高趋势。

2.3 蛋白质印迹检测

图 1 大鼠旷场实验结果Figure 1 The results of open field test of rats

图 2 大鼠旷场轨迹图Figure 2 Trajectories of open field test of rats

图 3 大鼠高架十字迷宫实验结果Figure 3 The results of elevated plus maze test of rats

如图4所示，与正常组大鼠海马体脑区的蛋白表达量相比，Bayk8644组CaMKⅡ、pho-CaMKⅡ蛋白表达明显升高（P＜0.01，P＜0.05），BDNF蛋白表达明显降低（P＜0.05），而芍药苷组与之无明显差别。与Bayk8644组相比，芍药苷高剂量组CaMKⅡ和pho-CaMKⅡ蛋白表达明显降低（P＜0.01，P＜0.05），BDNF蛋白表达明显升高（P＜0.05），而芍药苷中剂量组和低剂量组与Bayk8644组之间无明显差异。尼莫地平组BDNF蛋白表达量与Bayk8644组相比有升高趋势。

3 讨论

抑郁和焦虑是典型的精神障碍性疾病，抑郁症以情绪低落为主要表现，焦虑主要以精神和躯体的焦虑症状为主，表现为紧张、畏惧和回避的行为反应。抑郁焦虑在临床上常常与其他疾病伴行，加重疾病的发生，影响预后。随着人们生活和工作节奏的加快，抑郁和焦虑发病率也逐年升高，保守估计我国发病率大约在7%[4]。该病的发病机制复杂，其病因机制是国内外研究的焦点。全基因组关联研究证实，编码LTCCα1C 亚基的CACNA1C基因是精神障碍的风险基因，CACNA1C基因SNP rs1006737通过影响基因表达和L型钙电流密度介导抑郁、精神分裂症等情感障碍性疾病的发生[5]。因此，本研究利用LTCC激动剂Bayk8644延长LTCC开放，增加细胞内钙离子浓度，观察其介导的抑郁焦虑行为，通过行为学实验和蛋白质印迹实验检测芍药苷的药理作用靶点。结果发现Bayk8644可以引发大鼠抑郁和焦虑行为，而芍药苷可通过L型钙通道改善大鼠的抑郁和焦虑行为。

本实验结果显示，Bayk8644可降低大鼠上述旷场实验指标，说明Bayk8644可诱导大鼠产生抑郁焦虑行为。提前给予芍药苷7d后再注射Bayk8644，上述指标与正常组大鼠相比无显著差异，初步说明芍药苷可以拮抗Bayk8644引起的抑郁焦虑样行为。本研究中高架十字迷宫实验结果显示， Bayk8644可降低大鼠的OE%和OT%，提示Bayk8644可诱导大鼠产生焦虑行为，与旷场实验结果一致；而芍药苷干预组大鼠的OE%和OT%指标与正常大鼠无显著区别。结合旷场实验结果，作者认为芍药苷可以改善Bayk8644诱导的大鼠抑郁焦虑样行为。

Ca2+经L型钙通道进入细胞后与钙调蛋白发生结合，并激活CaMK Ⅱ使其发生磷酸化[6-7]。为进一步验证旷场实验结果，本研究采用蛋白质印迹法检测了CaMK Ⅱ的磷酸化水平及其下游BDNF的表达情况，结果显示，Bayk8644可以增加大鼠海马脑内CaMKⅡ蛋白磷酸化水平，降低BDNF的表达，而芍药苷给药组无显著变化。研究发现，抑郁症患者血清BDNF水平以及抑郁症自杀患者大脑中BDNF的含量均明显低于健康人[8-9]，经药物治疗后血清BDNF含量显著高于未被治疗者[10]。抑郁症大鼠模型的实验结果也与临床试验结果一致[11-12]。本课题组前期研究发现，抑郁模型大鼠海马体脑区中钙离子浓度升高，CaMKⅡ的蛋白磷酸化水平和mRNA的表达量升高[13-14]，结合本研究结果，推测芍药苷可以通过拮抗L型钙通道降低细胞内Ca2+浓度，并通过调节其下游CaMKⅡ/BDNF通路的活化发挥其药理作用。本研究虽然发现尼莫地平有拮抗Bayk8644的作用，但是拮抗作用不显著，可能与没有设置尼莫地平高、中和低剂量组以及动物数量有限有关，有待继续开展相关研究。