内质网应激对肝泡型包虫病部分炎症介质的影响

李 姚，王靖超，袁加琪，温 浩，周 瀛，樊海宁，王志鑫

1 青海大学附属医院 肝胆胰外科，西宁 810000；2 新疆医科大学第一附属医院 消化血管外科中心肝胆包虫外科，乌鲁木齐 830000

棘球蚴病存在于我国西部多个省份，中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所对我国青海、四川、云南等9个省抽样调查发现，流行区域的患病率为0.28%[1]。肝泡型包虫病(hepatic alveolar echinococcosis，HAE)可以经淋巴道和血管转移到腹膜后和远隔器官如脑、肺等，故有“虫癌”之称[2-3]。该病目前仍是世界范围内一个重要的公共卫生问题[4-5]。

肝包虫病发病初期症状不明显，症状出现后病情会快速加重[6-7]。目前切除手术是治疗肝包虫病的最佳手段，药物治疗的效果有限。因此，寻找到新的治疗方法和药物非常重要。有研究[8]表明，硼替佐米(bortezomib，BTZ)对包虫病小鼠的原头节和后绦幼虫有杀灭作用，其作用机制与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)有关。本项课题初步研究HAE中ERS与部分炎症介质的相关性，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月—2019年9月因HAE在青海大学附属医院接受肝脏部分切除术的患者15例，切除HAE病灶边缘带作为AE组，同期肝脏正常组织15例作为对照组。

1.2 检测指标 采集AE组病灶边缘带和正常肝组织，并收集一般临床资料，采用Western Blot检测病灶边缘带和正常组织中蛋白激酶R样激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT-enhancerbindingproteinε, CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12(cysteine-containing aspartate-specific proteases 12,caspase-12)和葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP-78)的表达情况，实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测病灶边缘带和正常组织中IL-6、IL-9、TNF的表达。

1.3 主要仪器及试剂 主要仪器有冷冻离心机(heal force，neofuge 13R)、转印电泳仪(北京六一仪器厂，DYCZ-40D)、qRT-PCR仪(ABI，Stepone plus)、超微量分光光度计(Thermo，Thermo)。主要试剂包括RIPA裂解液、50*cooktail、PMSF、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、HRP标记二抗、RNA提取液、FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)等。

1.4 检测方法和步骤

1.4.1 Western Blot法检测步骤 将肝组织块洗涤后剪成小块置于匀浆管中彻底匀浆。将匀浆完成的样本管取出，进行冰浴、震荡确保组织完全裂解。离心后收集上清，即为总蛋白溶液。配制分离胶，加入TEMED后摇匀灌胶。凝固后开始电泳，然后转膜。加入一抗后孵育过夜，洗涤加入二抗，孵育、洗涤后经化学发光、显影和定影，使用Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值，即蛋白质表达水平。

1.4.2 相关蛋白和炎症因子mRNA表达水平的检测 取100 mg组织，加入到有1 ml Trizol Reagent的匀浆管中。离心后取上清。加入三氯甲烷，充分混匀，静置。再次离心后管底的白色沉淀即为总RNA。然后逆转录成cDNA，用PCR仪进行扩增。目的基因表达阳性的标本荧光定量扩增曲线呈S形，从qRT-PCR仪系统中读取CT值。结果处理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)，B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)，K=A-B，表达倍数=2-K。基因引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.5 伦理学审查 本研究方案经由青海大学附属医院伦理委员会审批，批号：P-SL-2019072，所有纳入患者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 ERS相关蛋白表达水平 AE组PERK、CHOP、caspase-12和GRP-78表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表2)。

表2 两组间ERS相关蛋白表达水平的比较

2.2 ERS相关指标mRNA的表达水平 AE组的PERK、CHOP、caspase-12和GRP-78的 mRNA表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表3)。

表3 两组间ERS相关指标mRNA表达水平的比较

2.3 炎症介质mRNA的表达水平 AE组IL-1β、IL-6、TNF的 mRNA表达水平较对照组明显增高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表4)。

表4 两组间相关炎症介质mRNA表达水平的比较

2.4 ERS蛋白与炎症介质相关性 Pearson相关分析ERS相关蛋白与IL-1β、IL-6、TNF的相关性，结果显示PERK、CHOP、capcase12、GRP-78与IL-6、IL-1β、TNF具有正相关性(P值均<0.05)(表5)。

表5 ERS相关蛋白与炎症介质的相关性

3 讨论

棘球蚴感染导致严重的慢性人畜共患寄生虫疾病，在畜牧养殖地区广泛流行[9]。此病仍是一个世界公共卫生问题[10]。阿苯达唑是目前唯一用于包虫病术前术后的口服药物[11]，由于其疗效差、并发症多，找到新的治疗药物成为重要问题。据Nicolao等[12]研究，硼替佐米对多房棘球蚴虫具有高水平的杀伤作用。硼替佐米作为一种用于骨髓瘤化疗的蛋白酶体抑制剂[13-14]，虽然有研究[15]表明其对多房棘球蚴虫具有杀伤作用，但此药物仍然不能在HAE临床治疗中使用，这还需要更多进一步的研究。

内质网是哺乳动物细胞中必不可少的细胞器，其膜结构占细胞内膜的1/2，在内膜系统中占有非常重要的地位[16]。损伤因子作用于内质网，造成蛋白质加工、运输障碍或钙吸收、释放障碍，导致各种蛋白质的重叠、折叠式蛋白堆积和细胞内的钙离子不均衡，从而激活重叠的蛋白反应，即非折叠蛋白反应。而非折叠蛋白反应信号通路通过细胞凋亡途径引起细胞损伤甚至死亡[17-18]。内质网膜上有3种能够感受到腔内未折叠蛋白堆积的特殊蛋白质感受器，分别为PERK、IRE-1、ATF6[19]。PERK是一种跨膜蛋白，具有N端应力传感结构域和胞质激酶结构域[20]。IRE1是最保守的压力传感器,有两个亚型(IRE1α、IRE1β)存在于哺乳动物[21]。ATF6是一种跨膜蛋白，具有胞质bZIP转录因子域，包含两种哺乳动物亚型ATF6α、ATF6β[22]。当其激活时,ATF6α通过蛋白酶裂解S1P、S2P,释放胞质片段,迁移到核调节基因转录[23]。虽然内质网在肝细胞中的作用已被广泛研究，但其在肝脏非实质部分的功能尚未被探索[24]。因此，研究可能影响肝脏炎症和细胞ERS的相关因素具有重要意义。

在HAE中包虫的存活和侵袭能力可能与非折叠蛋白反应有关[25]。为了保护肝脏免受包虫的损害可以恢复正常的蛋白稳态。一些治疗方案可以转录重组内质网，以继续保护机体不暴露于折叠不当的分泌蛋白，而不是导致过度的ERS引起的炎症和细胞死亡。因此，在肝脏系统生理和病理反应之间保持平衡稳态，以内质网为治疗靶点是目前可能的药物治疗方向。

肝脏的损伤和破坏是由于细胞过多的死亡和肝组织中基质的过量损失而表现出来的。胞体压力本身促进了ERS，与炎症反应有进一步的相互作用，可以通过炎症反应促进细胞外基质的水解。但是具体的调节机制不明确。

在本研究中，基于相关研究分析了HAE边缘带组织中ERS表现的变化。结果显示，在AE组肝脏边缘的PERK、CHOP、caspase-12、GRP-78的表达水平明显高于对照组，表明HAE的肝组织中ERS的表现明显更为活跃，提示ERS的过度活化与HAE的发生发展有关。各种炎性细胞浸润肝细胞及其周围组织，分泌大量的炎症介质使炎症反应级联放大。IL-1β、IL-6、TNF是活性化后浸润到肝组织的炎症介质。在AE组中IL-1β、IL-6、TNF的分泌量明显高于对照组，表明HAE病情的发展以及对肝细胞和肝组织的破坏与炎症介质有关。ERS相关蛋白PERK、CHOP、caspase-12、GRP-78与炎症介质IL-1β、IL-6、TNF呈正相关性，提示ERS和HAE炎症反应存在一定程度的相关，ERS促进了HAE的发展。因此笔者认为，HAE中ERS的激活与炎症介质的活性化存在相关性，ERS的过度激活能够改变部分炎症介质的分泌来加剧肝损伤，具体机制有待进一步研究。抗ERS治疗有望成为HAE药物治疗的潜在方式。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：李姚、王靖超、袁加琪、温浩、周瀛、樊海宁、王志鑫负责课题设计、资料分析；李姚、王靖超负责收集数据与撰写论文；李姚、王靖超、王志鑫参与修改论文；温浩、周瀛、樊海宁、王志鑫责拟定写作思路，指导撰写论文并最后定稿。