副猪嗜血杆菌河南分离株的优势血清型和毒力基因研究

张青娴，徐引弟，王治方，朱文豪，焦文强，李海利

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）是猪多发性浆膜炎和关节炎（Glasser's disease， 格拉瑟病）的病原体，常定植在猪的上呼吸道，在环境应激和感染免疫抑制性疾病时副猪嗜血杆菌进入血液暴发本病，引发全身性细菌感染[1]。

HPS至少分为15种血清型，我国流行的血清型为1、4、5和13，河南省以4型和5型居多[2-6]。目前防控本病的主要措施是使用抗生素和疫苗接种，常用的疫苗为全细菌灭活苗，但只对血清型1、4、5和6有保护力[7-9]。血清型之间的交叉保护不一致，也缺乏区分感染猪和疫苗猪的可用方法，当疫苗株与临床分离株血清型不一致时，疫苗无法提供足够的免疫保护。HPS血清型被视为毒力的重要标志，根据Oliveira等[10]的方法，不同血清型的HPS被分为3类：强毒力（血清型1、5、10、12、13和14）、中等毒力（血清型2、4和15）和无毒力（血清型3、6、7、8、9和11）。不同血清型的副猪嗜血杆菌分离株可携带不同的毒力基因，相同血清型的分离株也可表现出不同程度的毒力[11-13]。

目前HPS致病性毒力因子的数量与功能尚未完全探究清楚。乐敏首次绘制出HPS SH0165株基因组的潜在毒力因子图，筛选出部分主要的毒力相关基因或操纵子基因（nanH、oapA、ompP5、pilA、ompP2、cdtABC、hhdAB、prtC、sodAC、sphB、espP、fkpA、mip、mviN和HAPS-0694），发现这些基因在我国HPS流行菌株中高度保守，很有可能是引起HPS致病力的关键因子[14]。研究发现，lsgB基因只存在于毒性菌株中[15]；capD基因编码一种多糖生物合成蛋白，且与副猪嗜血杆菌的毒性有关[16]；wza基因在毒力因子荚膜多糖转运过程起重要作用，缺失wza基因能使HPS毒力显著降低[17]；体内感染条件下，cdtABC和hhdAB均出现上调表达，是HPS直接发挥细胞毒性作用的重要武器[14]；vta3在毒力菌株和无毒力菌株中均高度保守，而vta1和vta2主要在致病菌株中为阳性[18]；HPS具有神经氨酸酶基因nanH和神经氨酸酶活性[19]，与细菌黏附有关的外膜蛋白ompP2在毒力株中存在部分碱基缺失[20-21]，而胞外丝氨酸蛋白酶（extracellular serine protease,espP2）在HPS感染过程中表达[22]。对田间分离株检测毒力基因，并分析毒力基因与血清型的相关性，有助于预测HPS分离株的致病力和防控格拉瑟病。

本试验通过对河南省HPS血清型分型和毒力基因扩增试验，分析毒力因子的功能及其与血清型的相关性，为进一步认识该菌致病机理及研发新型亚单位疫苗和诊断试剂提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

受试菌株分离于2017—2018年河南地区具有典型格拉瑟病症状的病猪，由河南省农业科学院畜牧兽医研究所传染病研究室分离、鉴定与保存，共计46株HPS（表1）。

1.2 主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB），美国BD公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），Sigma公司；革兰氏染色液，珠海贝索生物技术有限公司；新生牛血清，郑州益康生物工程有限公司；PCR分子生物学试剂，宝生物（大连）工程有限公司；DMSO和甘油等普通化学试剂，北京陆桥技术股份有限公司。

1.3 血清分型

参考Howell等[23-24]的方法，合成用于鉴定HPS血清型的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系共25 μL，包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix，上下游引物（50 μmol/L）各1.5 μL，2 μL DNA模板（浓度约20 ng/μL），0.25 μL DMSO和7.25 μL超纯水。PCR反应条件：94 ℃初始变性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪上进行观察分析。

表1 46株HPS分离株的背景信息

1.4 毒力基因鉴定

参考乐敏等[14，25-26]的方法，合成鉴定HPS毒力因子的引物（表2），由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系共25 μL，包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix，上下游引物（50 μmol/L）各2 μL，7.5 μL超纯水和1 μL DNA模板（浓度约20 ng/μL）。反应体系如下：94 ℃初始变性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃延伸5 min。使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

表2 毒力基因引物序列

2 结果

2.1 副猪嗜血杆菌的分离情况

根据分离部位统计，2017—2018年河南省副猪嗜血杆菌的分离率在肺组织中最高（47.8%，22/46），其次是气管（37%，17/46），心血、脑组织和关节分离率均不高（表3）。

表3 副猪嗜血杆菌分离株在不同样品中的血清型分离率

2.2 副猪嗜血杆菌的血清型分布

46株HPS一共鉴定出7种血清型（表3）。血清型5/12（32.6%，15/46）最常见，其次是血清型4（26.1%，12/46）、血清型7（15.2%，7/46），血清型2和血清型13均分离到3株（6.5%，3/46），血清型6分离到1株（2.2%，1/46），血清型11分离到2株（4.3%，2/46），未分离到血清型1、3、8、9、10、14和15，有3株为未定型菌株（6.5%，3/46）。

2.3 副猪嗜血杆菌的毒力基因测定

46株HPS的毒力基因分布情况见表4，wza（4/46，8.7%）分离率很低，只出现在强毒株中。lsgB（5/46，10.8%）、capD（4/46，8.7%）分离率低，且在高、中等毒力菌株中呈阳性。vta2（22/46，47.8%）、vta3（16/46，34.8%）、hhdA（24/46，52.2%）、hhdB（25/46，54.3%）、cdtA（24/46，52.2%）、cdtB（28/46，60.8%）、cdtC（26/46，56.5%）分离率较高，且均存在于强毒株或中等毒力菌株中。vta1、nanH、ompP2、espP2在分离株中阳性率较高，阳性率分别为73.9%（34/46）、67.4%（31/46）、80.4%（37/46）和56.5%（26/46），且无毒力区分。强毒株所含毒力基因最多，其次是中等毒力毒株。

表4 副猪嗜血杆菌血清型相关的毒力基因分布信息

2.4 血清型与毒力基因的关系

所有血清型的菌株至少携带1个毒力基因（表4）。毒力菌株与某些毒力基因的存在有很强的相关性。试验显示，无毒力菌株一般只含有vta1、ompP2、nanH和espP2基因，大多数毒力基因分布在高度和中等毒力组（表4）。相比之下，中等和无毒力性菌株出现vta3的概率非常低，中高度毒力菌株与lsgB、capD、vta1有很强的相关性。

3 讨论

2017—2018年从河南省不同地区具有典型格拉瑟病症状的病猪中分离到46株HPS，其血清型和毒力基因分布呈现多样性和复杂性。肺脏和气管为HPS主要分离部位，血清型5气管检出率高于肺组织，而血清型4肺组织检出率高于气管。血清型分型结果显示，HPS河南分离株流行的血清型为4型和5型，未分离到血清型1、3、8、9、10、14和15，与河南省副猪嗜血杆菌历年流行的血清型一致[3-6]。心血、脑组织和关节的分离率很低，但其分离株均为中等毒力或强毒株，肺脏的高分离率提示2017—2018年HPS在河南省仍以强毒株流行为主[27]。

所筛选的14个毒力基因多存在于强毒株和中等毒力株中，无毒力株一般只含有vta1、ompP2、nanH和espP2基因。vta1、nanH、ompP2、espP2在河南省HPS流行菌株中高度保守，在毒力菌株和无毒力菌株中均存在，推测所筛选的毒力基因很有可能是HPS致病关键因子。由此推测可能存在多个毒力基因协同作用，使HPS菌株产生相对较高的毒力，对毒力基因的检测可以作为将HPS血清型分为不同毒力组的补充方法。HPS毒力因子的界定将大幅提高毒力和非毒力菌株的鉴别，需要更多的研究来验证副猪嗜血杆菌各毒力蛋白的具体作用[26，28]。

综上所述，本研究分离的46株HPS多数含有多个毒力基因，可能存在多个毒力基因的协同作用，是否上述毒力因子是决定HPS致病力的基因还有待于进一步的基因敲除与回归试验验证[29]；是否被界定为中等和强毒株的血清型中均含有上述毒力基因有待进一步扩大田间分离株范围[30-31]。

本文提供了2017—2018年河南省HPS血清型和毒力基因的第一手资料，研究了血清型与毒力基因的相关性，对了解河南省HPS流行病学特征和防控该病具有重要意义。