肠膜蛋白对加州鲈生长性能和肝肠健康的影响

熊 娟 王 标 杨红军 胡玲玲 文玲梅 高 坚

（1.山川生物科技（武汉）有限公司，湖北武汉430074；2.华中农业大学，湖北武汉430070；3.咸宁市农业科学院，湖北咸宁437100）

在水产养殖过程中，饲料成本占养殖成本的70%以上，而水产饲料价格的高低极大程度上取决于饲料中蛋白原料的价格。而鱼粉由于其适口性好、蛋白含量高、氨基酸比例平衡、富含高度不饱和脂肪酸和维生素，是特种水产饲料中主要的蛋白源[1]。近年来，随着水产养殖规模的扩大，饲料需求的增加及由于过度捕捞带来的鱼粉产量的递减，导致鱼粉难以满足饲料对蛋白的需要[2]。同时，由于2020年新冠疫情导致国外进口鱼粉无法进入国内，引起鱼粉价格飞涨。这就迫切需要寻找新的高性价比的蛋白源替代鱼粉。鸡肠膜蛋白粉（Dried Chicken Solubles, DCS）是以新鲜的鸡肠为单一来源，经一系列复合蛋白酶酶解处理后通过喷雾干燥等过程制造出来的新型功能性动物蛋白原料。由于鸡肠膜蛋白经过体外酶解后含有大量的小肽和游离氨基酸，可应用于多种动物及同种动物不同生长发育阶段的饲料。在猪上有大量的研究表明，添加适宜比例的肠膜蛋白替代进口鱼粉不仅可以提高仔猪采食量和日增重，还可以促进仔猪肠道绒毛发育，减少断奶应激和降低料肉比[3-7]。猪肠膜蛋白在水产饲料中仅见零星报道，研究发现用肠膜蛋白替代部分鱼粉可以改善大鳞副泥鳅的生长性能以及提高肝脏抗氧化能力[8]。但是关于鸡肠膜蛋白对水生动物生长性能以及肠道健康的影响还未见报道。

大口黑鲈又名加州鲈，原产于北美洲，是一种世界性的游钓鱼类。20 世纪70 年代引入我国，目前在广东、江浙、四川等地大量养殖，而且都取得较好的经济效益。为此，本试验选择加州鲈作为试验对象，使用3%的鸡肠膜蛋白等比例替代进口鱼粉（替代比例参考之前在乌鳢上梯度替代的结果），研究肠膜蛋白对加州鲈生长性能、肝脏和肠道健康的影响，旨在探索鸡肠膜蛋白促进水产动物生长的机制，为鸡肠膜蛋白应用于加州鲈等水生动物养殖和开发鱼粉替代物提供理论依据。

1 材料与方法

试验鱼购自湖北省武汉市鄂州市。试验鱼进入循环水系统前先进行系统的整体消毒。试验鱼进入循环水系统后，先暂养一周，以适应循环水系统的水环境。暂养期间投喂加州鲈商品饲料，每天两次，及时清理受伤死亡的鱼。本试验所用饲料在华中农业大学水产学院营养与生理实验室制备。鱼油和大豆油为脂肪源。豆粕、进口超级蒸汽鱼粉、鸡肠膜蛋白[山川生物科技（武汉）有限公司提供]及大豆分离蛋白为蛋白源，小麦粉作为黏合剂。其他饲料原料包括：磷酸二氢钙、氯化胆碱、矿物质混合物、维生素混合物、维生素C、纤维素。纤维素作为调和剂。饲料配方及营养水平见表1。

试验设置1 个对照组和1 个试验组，试验组是在对照组基础上每吨饲料中用30 kg的肠膜蛋白等比例替代进口鱼粉，每组3 个重复。随机选取300 尾健康的（初始体重3.5 g 左右）加州鲈，随机分配到6 个网箱，每个网箱50尾鱼。采用饱食投喂的方式（初始投喂量占体重4%），精确称量、记录投喂量。同时，每天记录死鱼情况，定期清洁残余饵料和粪便，保持循环水系统稳定，试验期间水温(28±0.5) ℃，溶解氧(6±0.5) mg/L，pH值7.6±0.1。试验期8周。

2 样品采集与检测

养殖试验结束后（8周），停食24 h，统计每缸鱼的数量并用吸水纸擦干后称重，统计存活率、增重率、饵料系数、特定增长率等生长性能。

每缸随机取3 尾鱼用浓度为100 mg/L 的鱼安乐（MS-222）麻醉，用无菌注射器采血。采集的样品放在离心管中，冰上放置1～2 h，3 500 r/min离心10 min，吸取上层血清并分装离心管中，放置于-20 ℃冰箱，用来测定血清生化指标；每缸随机各选取4尾试验鱼解剖，解剖后观察内脏脂肪沉积情况，拍照，分离内脏团、肝脏、脾脏、肠道，将肝脏和肠道的附属物剔除，用生理盐水清洗干净，用滤纸吸干表面的水分，称重，放入冻存管，-20 ℃保存，准备进行肝脏生化指标测定；肠道取出食糜，液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱，准备测消化相关酶活力（胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶）；最后每缸随机选择3尾鱼，解剖取肝脏组织保存在多聚甲醛中，进行组织切片观察（HE染色和油红O染色）。

表1 试验饲料组成及营养水平（风干基础，%）

2.1 抗氧化指标测定

血浆甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活力，肝脏总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活力及糜蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶活力采用南京建成生物工程研究所（南京，中国）提供的试剂盒进行测定。

2.2 组织石蜡切片以及HE染色

将肝脏组织在多聚甲醛中固定24 h后取出，经酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋（58～60 ℃）、石蜡切片机（Leica RM2135）切片（厚度为5 μm）、摊片、烤片和HE 染色。染色的过程为：切片经二甲苯脱蜡→100%～50%酒精逐级复水→苏木精染色→流水冲洗氨水返蓝→50%～95%酒精逐级脱水→伊红染色→二甲苯透明→中性树胶封片→显微镜下观察拍照。

2.3 组织油红染色

将肝脏组织在多聚甲醛中固定24 h后取出，大致流程如下，肝脏冰冻样品在冷冻切片机上切片（厚度为6～8 μm）→室温干燥→10%甲醛缓冲液4 ℃固定120 min→蒸馏水漂洗→60%的异丙醇中漂洗→油红染液（0.3 g油红、60 mL异丙醇、40 mL蒸馏水）→60%的异丙醇漂洗→蒸馏水洗→苏木精中染色→甘油凝胶封片→Nikon 显微镜下观察拍照。

2.4 肝脏脂肪含量测定

在冰箱中取出完整的肝脏组织，称重m0，室温化冻后测定脂肪含量：

第一步：将肝脏组织放在EP管内加钢珠，管中加入1 mL 甲醇∶三氯甲烷（1∶1）溶液，匀浆机匀浆至无组织块；第二步：每管补充0.5 mL 超纯水，充分混匀后低速离心，3 000 r/min 离心5 min，用注射器吸取下层有机相转入新的EP 管（称量重量m1），重复2 次；第三步：将EP 管内脂肪用氮吹仪吹干，称量重量m2；第四步：计算肝脏组织脂肪含量（%）=(m2-m1)/m0×100。

3 数据处理与分析

采用SPSS 22.0 统计软件将数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05 表示具有显著性差异，数据用“平均值±标准差”表示。

4 试验结果与分析

4.1 肠膜蛋白对加州鲈生长性能的影响(见表2)

表2 肠膜蛋白对加州鲈生长性能的影响

表2 结果显示，和对照组相比，3%的肠膜等比例替代进口鱼粉，可以提高加州鲈末重、增重率和特定生长率，降低饵料系数（P＞0.05）。

4.2 肠膜蛋白对加州鲈消化吸收能力的影响(见表3)

表3 肠膜蛋白对加州鲈肠道消化酶活力的影响

表3 可见，和对照组相比，肠膜蛋白替代进口鱼粉可以显著提高加州鲈肠道糜蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶活力（P＜0.05）。

4.3 肠膜蛋白对加州鲈血液指标的影响(见表4)

图1 肠膜蛋白对加州鲈肝脏和肠道发育的影响

表4 结果显示，和对照组相比，肠膜组可以显著降低加州鲈血液中胆固醇（TC）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和丙二醛（MDA）含量（P＜0.05）。与对照组相比，肠膜组可以显著提高加州鲈血液中总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）含量（P＜0.05）。

表4 肠膜蛋白对加州鲈血液指标的影响

4.4 肠膜蛋白对加州鲈肝脏和肠道健康的影响(见图1～图2)

图2 肠膜蛋白对加州鲈肝脏脂肪含量的影响

肝脏和肠道生长发育的结果显示，肠膜蛋白可以显著增加加州鲈肝体比（P＜0.05），说明肠膜蛋白可以促进加州鲈肝脏的生长发育，但是对于肠道的发育，鸡肠膜蛋白有增加肠体比的趋势，但是和对照组相比差异不显著（P＞0.05）。肝脏脂肪含量的结果显示，和对照组相比，肠膜组可以显著降低加州鲈肝脏脂肪含量（P＜0.05），这与肝脏油红染色和HE染色结果一致（见图3～图4）。同时，肠道切片结果显示（见图5～图6），肠膜组可以增加肠道绒毛高度，促进肠道绒毛发育。

4.5 肠膜蛋白对加州鲈肝脏抗氧化能力的影响(见表5)

表5 结果显示，和对照组相比，肠膜组可以显著提高加州鲈肝脏Gpx 以及CAT 活性，显著降低MDA含量（P＜0.05）。

5 讨论

5.1 肠膜蛋白对加州鲈生长性能的影响

图3 肝脏HE染色

图4 肝脏油红染色

前期在乌鳢上，通过添加3%、6%和9%的鸡肠膜蛋白等比例替代进口鱼粉，以肠膜蛋白添加量和乌鳢增重率之间的折线模型分析得出鸡肠膜蛋白替代鱼粉最佳比例为3.31%（如图7）。为此，本试验选取3%的鸡肠膜蛋白等比例替代进口鱼粉。本试验的结果显示，3%的肠膜蛋白等比例替代进口鱼粉可以提高加州鲈的增重率以及特定生长率。这与陈建在斑点叉尾鮰上的研究得到相似的结论[9]。肠膜蛋白对加州鲈生长的促进作用一方面与鸡肠膜中富含大量的小肽有关（小肽含量45%）。传统营养理论认为，蛋白质经动物采食后在蛋白酶及胰消化酶等作用下分解成一部分肽和大部分游离氨基酸，肽在肽消化酶的作用下再分解成游离氨基酸，然后才直接被动物消化吸收[10]。研究表明，肽在动物体内有着独立氨基酸的代谢途径和机制，肽可被动物胃肠道完整的吸收转运，被动物组织所利用[11]。Gilbert 等[10]研究发现小肠上的肽载体吸收能力高于各种氨基酸载体吸收能力的总和。其次可能与肠膜蛋白加州鲈提高饲料效率有关。本研究结果表明，肠膜蛋白替代鱼粉后提高了加州鲈饲料效率。肠道是鱼类消化吸收的主要场所，而鱼类的消化吸收能力与消化吸收酶的活性密切相关[12]。胰蛋白酶和糜蛋白酶是由膜腺细胞分泌的进入鱼类肠道进行专一性水解蛋白质的蛋白酶类[13]。脂肪酶能将长链三酰甘油水解生成脂肪酸和甘油单酯。本研究表明，饲料中添加肠膜蛋白可以显著提高加州鲈肠道胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活力，说明适宜水平的肠膜蛋白能够提高加州鲈的消化能力。此结果与大鳞副泥鳅上的结果相似[8]。消化吸收酶的活力的提高与肠道和肝胰脏结构健康有关。为此，研究了肠膜蛋白对加州鲈肝脏和肠道健康的影响。

表5 肠膜蛋白对加州鲈肝脏抗氧化能力的影响

图6 肠道油红染色

图7 鸡肠膜蛋白添加量与乌鳢增重率之间的折线模型分析

5.2 肠膜蛋白对加州鲈肠道和肝脏健康的影响

鱼类肝胰脏和肠道的生长发育与其消化吸收能力有关[14]。本研究表明，鸡肠膜蛋白替代鱼粉后，可以提高加州鲈肠体比和肝体比，说明肠膜蛋白可以通过促进消化吸收器官的生长发育，促进加州鲈的生长。为了进一步探索肠膜蛋白促进肠道和肝脏发育机制，我们通过肝脏和肠道切片，分析其微观结构的变化。本试验的结果显示，鸡肠膜蛋白替代鱼粉后可以提高绒毛高度，促进肠道绒毛发育。这可能与鸡肠膜蛋白中含有大量谷氨酸和天冬氨酸有关（鸡肠膜蛋白中谷氨酸和天冬氨酸合计16%以上）。在仔猪上的研究发现，天冬氨酸和谷氨酸是小肠黏膜的主要能量来源，添加这两种氨基酸可以促进仔猪肠道绒毛的发育[15]。李晋南[16]在松浦镜鲤上的研究也发现，谷氨酸可以改善鲤鱼肠道健康。肠道的主要功能是消化和吸收营养物质，肝脏的主要功能被认为是物质代谢和解毒。近年来，研究发现肠道和肝脏不是两个相互独立的器官，而在生物学功能上密切相关，相互影响，机体肠道与肝脏间的交互作用形成肠-肝轴[17]。为此，我们接下来分析了肠膜蛋白对加州鲈肝脏结构的影响。试验结果显示，鸡肠膜蛋替代鱼粉后可以降低肝脏脂肪的沉积，说明肠膜白蛋白可以改善肝脏健康。肠道和肝脏的健康很大程度上与其细胞结构完整性有关[18]。而在鱼类组织中含有大量的不饱和脂肪酸，极易受氧自由基攻击而形成脂质过氧化等，改变细胞膜的通透性和流动性，导致机体的结构和细胞发生氧化损伤[19]。

5.3 肠膜蛋白对加州鲈机体抗氧化能力的影响

机体的抗氧化能力对鱼类尤为重要，而血清的抗氧化指标能够反映机体的总体抗氧化状态，对于评估其抗氧化能力尤为重要[20]。在鱼上，丙二醛（MDA）是反映机体脂质过氧化的敏感指标[21]。本试验的研究结果显示肠膜蛋白可以显著降低血液中MDA 含量，说明肠膜蛋白可以通过降低氧化损伤保护机体结果完整性。一般而言，为了抵御外界的氧化应激，机体会产生酶性抗氧化系统来抵御氧自由基诱导的损伤[22]。本试验的结果显示，添加肠膜蛋白可以显著提高血液中SOD、CAT 和Gpx 的活力，而且与MDA 呈现相反的趋势，说明肠膜蛋白通过提高酶性抗氧化活性降低脂质过氧化，保证其结构完整性。这与本试验在肝脏中的测定结果一致，说明肠膜蛋白也可以通过提高肝脏抗氧化酶活力降低肝脏中脂肪氧化，从而保证肝脏结构完整性。肠膜蛋白提升机体抗氧化酶活力，可能与鸡肠膜中富含功能性小肽有关。苏玥宁等在草鱼上的研究发现，饲料中添加功能性小肽可以通过激活机体Nrf2-Keap1系统调节抗氧化酶基因表达，从而调节机体抗氧化系统[18]。同时，我们也测定了血液中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）活力。而血液中AST和ALT的活力可以反映肝脏健康的关键指标，当血液中AST 和ALT 活力升高，说明肝脏结构存在损伤，导致肝脏中这2 种酶进入血液[23]。我们的结果显示，与对照组先比，肠膜组血液中AST 和ALT 活性显著降低，说明肠膜蛋白可以降低鱼粉中氧化的脂肪诱导的肝脏损伤。

6 结论

试验结果表明，在饲料中用3%肠膜蛋白等比例替代进口超级蒸汽鱼粉可通过提高肠道消化酶活力、肠道绒毛发育、血清和肝脏抗氧化酶活力，改善肝脏健康，从而促进加州鲈生长。