不同条件对蜂蜜发酵过程中高级醇生成的影响

董彩文 ，王浩瑾，骆怡萍，蒋雅楠，杨晓磊 ，胡晓龙 *

1. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院（郑州 450002）；2. 河南省食品生产与安全协同创新中心（郑州 450002）；3. 郑州轻工业学院校医院（郑州 450002）；4. 长葛市颐恒健蜂业有限公司（长葛 461502）；5. 许昌市蜂蜜发酵工程技术研究中心（长葛 461502）

高级醇主要包括异戊醇、异丁醇等[1]，在酿酒过程中产生。适量的高级醇在酒中能够产生独特的风味，如果量很低则酒的风味单薄。在存放过程中，高级醇能够转化变成酯类，从而使酒体呈现特殊的陈香。如果高级醇含量过高时则会危害人体健康。因此，对于酒中的高级醇含量应该采取一定的措施进行控制。除了筛选低产高级醇的酵母品种以外[2]，改变发酵条件也会影响高级醇的产生[3-7]。

试验通过单因素试验，确定发酵温度、发酵液pH、酵母添加量、发酵时间、磷酸氢二铵添加量、发酵液初始糖度等因素对高级醇生成的影响，然后经过响应面分析得到高级醇最低生成值，并进行验证试验，进而达到通过控制发酵工艺降低高级醇生成的目的。

1 材料与方法

1.1 主要材料

枣花蜜（河南省长葛市）；苏-16麦曲（江苏省）；高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）。

HH-S2数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗机械厂；SW-CJ-1D型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；TG16-WS台式高速离心机，湘仪离心机仪器有限公司；LX-C35L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，合肥华泰医疗设备有限公司；电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；UV9100全自动紫外可见分光光度计，美国Lab Tech公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 高级醇标准曲线的制作

参照文献[8]方法，分别取不同量的高级醇标准使用液，与0.5%对二甲氨基苯甲醛浓硫酸溶液反应，产物于520 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

1.2.2.2 样品中高级醇的测定

参考标准曲线的步骤，馏出液取0.5 mL。然后由回归方程计算出样品的高级醇含量。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 发酵温度对高级醇生成的影响

取适量蜂蜜和蒸馏水配制2 500 mL糖度为16%的蜜液，调节pH至4.0。80 ℃水浴20 min，取出冷却。在超净工作台中将蜜液依次倒入10个锥形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入麦曲10 g，高活性干酵母0.5 g，摇匀。分别在24，26，28，30和32 ℃培养箱中培养3 d。每个温度做2瓶样品，作为平行试验。培养结束后离心，取上清液蒸馏，进行高级醇的测定。

1.2.3.2 酵母添加量对高级醇生成的影响

取适量蜂蜜和蒸馏水配制2 500 mL糖度为16%的蜜液，调节pH至4.5。80 ℃水浴锅中20 min，取出冷却。在超净工作台中将蜜液依次倒入10个锥形瓶中，每瓶250 mL。然后加入麦曲10 g，依次加入高活性干酵母0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 g，放入30 ℃培养箱中培养3 d。每种酵母添加量做2瓶样品，作为平行试验。培养结束后离心，取上清液蒸馏，进行高级醇的测定。

1.2.3.3 发酵时间对高级醇生成的影响

取适量蜂蜜和蒸馏水配制2 500 mL糖度为22%的蜜液，调节pH至4.5。80 ℃水浴20 min，取出冷却。在超净工作台中将蜜液依次倒入10个锥形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入麦曲10 g，高活性干酵母0.5 g，放入30 ℃培养箱中培养。培养时间依次为3，4，5，6和7 d。每个发酵时间做2瓶样品，作为平行试验。培养结束后离心，取上清液蒸馏，进行高级醇的测定。

1.2.3.4 磷酸氢二铵添加量对高级醇生成的影响

取适量蜂蜜和蒸馏水配制2 500 mL糖度为22%的蜂蜜液，调节pH至4.5。80 ℃水浴20 min，取出冷却。在超净工作台中将蜜液依次倒入10个锥形瓶中，每瓶250 mL。磷酸氢二铵加入量分别为300，600，900，1 200和1 500 mg/L，麦曲10 g，高活性干酵母0.5 g，放入30 ℃培养箱中培养5 d。每个磷酸氢二铵添加量做2瓶样品，作为平行试验。培养结束后离心，取上清液蒸馏，进行高级醇的测定。

1.2.3.5 发酵液糖度对高级醇生成的影响

取适量蜂蜜和蒸馏水配制糖度分别为16%，20%，24%，28%和32%的蜜液，每瓶250 mL，调节pH至4.5。80 ℃水浴20 min，取出冷却。然后依次加入磷酸氢二铵900 mg/L（225 mg），麦曲10 g，高活性干酵母0.5 g，放入30 ℃培养箱中培养5 d。每个糖度做2瓶样品，作为平行试验。培养结束后离心，取上清液蒸馏，进行高级醇的测定。

1.2.4 响应面试验设计

在分别考察了单个因素对蜂蜜发酵过程中高级醇的影响后，选取3个对高级醇生成影响较大的因素，然后在每个因素方向选取3个数值进行响应面分析试验，如表1所示。

表1 试验因素设计

1.2.5 数据处理

以上试验均平行重复2次，用软件进行数据显著性检验，用不同的小写字母表示2个变量之间的显著关系，相同的小写字母表示2个变量之间的关系不显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 高级醇标准曲线的绘制

按照高级醇标准曲线的步骤得到的标准曲线见图1。得到方程为y=0.003 7x+0.009，R2=0.989 3，线性较好，符合要求。

图1 高级醇标准曲线

2.1.2 发酵温度对高级醇生成的影响结果

温度是发酵过程中的重要因素。因此温度对发酵有一定影响[9]。由图2可知，随着温度升高，高级醇的生成量随温度升高而上升，在28 ℃达到最大，然后开始下降。考虑到温度低时发酵时间延长，温度高时易引起杂菌生长，初步选择发酵温度为30 ℃。

图2 发酵温度对高级醇的影响

2.1.3 酵母添加量对高级醇生成的影响结果

发酵过程中，酵母菌的数量与发酵力的大小相对应。图3表明，随着酵母添加量的增加，高级醇的生成量随着升高，然后趋于缓慢变化。初步选定酵母添加量为0.5 g。

图3 酵母添加量对高级醇的影响

2.1.4 发酵时间对高级醇生成的影响的结果

由图4可知，随着发酵时间增长，高级醇的量刚开始变化不大，第5天以后随发酵时间增长高级醇的生成量开始上升。发酵时间初步选为5 d。

2.1.5 磷酸氢二铵添加量对高级醇生成的影响的结果

发酵液中氮源过多容易造成酵母菌的生长太快，反而不利于产物的积累。当氮源不足时，菌体的生长缓慢，在稳定期会引起菌体自溶。因此控制适宜的氮源，既能促进菌体的生长，又有利于产物的积累。图5表明，磷酸氢二铵浓度的变化对高级醇的生成影响不明显。所以磷酸氢二铵质量浓度初步选为900 mg/L。

图4 发酵时间对高级醇的影响

图5 磷酸氢二铵添加量对高级醇的影响

2.1.6 糖度对高级醇生成的影响的结果

当发酵液中糖度过高时，不仅会抑制乙醇产生途径中乙醇脱氢酶的活性而影响发酵，不利于酒精产物的积累；而且会造成高渗透压环境而抑制酵母的生长。发酵液糖度过低又会减缓酵母生长，导致发酵不能正常进行[10]。由图6可知，刚开始高级醇的生成量随着发酵液糖度的升高逐渐上升，发酵液糖度为24%时，高级醇的生成量最高；之后随发酵液糖度升高而降低。考虑到低糖度下产生酒精度较低，发酵液糖度的可选28%～30%。

图6 发酵液糖度对高级醇的影响

2.2 高级醇响应面优化的结果

2.2.1 高级醇回归模型的建立和显著性检验

由响应面分析得到17组优化试验的方案，每组做2次平行试验后得到试验结果如表2。

表2 试验设计及结果

经响应面软件对数据进行拟合，得到回归方程：高级醇=+78.69-10.51A-13.01B+2.53C-5.24AB+4.61AC+ 5.84BC-7.45A2-7.19B2-3.22C2。方程中每项前系数的正负性可以表明其多Y值的影响是正相关还是负相关。

由表3可知，回归方程方程相关系数R2=0.809 4，表明约有80.94%的高级醇变化可由此模型解释。对糖度、温度、时间分别进行分析，发现糖度p＜0.05，温度p＜0.01，说明糖度和温度对酒精度的影响分别是显著和高度显著的。而时间p=0.533 6＞0.05，说明时间对酒精度影响不显著。综上所述，回归方程给酒精度提供了一个合适的模型。

表3 回归方程方差分析结果

2.2.2 验证试验

响应面优化分析结果显示，当发酵液初始糖度为32.0%，发酵温度为34.0 ℃，培养时间为4.0 d的时候能够得到高级醇的理论最低值为44.24 mg/L。为了验证该模型给出的方案是否与实际情况相符合，课题进行两次平行验证试验。发酵条件为发酵液初始糖度为32.0%，发酵温度为34 ℃，培养时间为4 d，由此得高级醇含量为44.19 mg/L，实际测定值与预测值的相对误差为0.11%，说明响应面模型能较好的反应实际情况。在响应面试验15中，当发酵液糖度为30.0%，发酵温度为34 ℃，培养时间为4 d时，得到的发酵液高级醇含量为43.72 mg/L。所以最适发酵条件为发酵液糖度为30.0%，发酵温度为34 ℃，培养时间为4 d时，能得到高级醇的最低值。

3 结论

在单因素试验基础上利用响应面对蜂蜜发酵中高级醇的生成条件进行优化。结果表明，高级醇的最优发酵工艺条件为麦曲添加量4%（10 g），酵母添加量0.2%（0.5 g），磷酸氢二铵添加量600 mg/L（150 mg），发酵液初始糖度为30.0%，pH为4.5，发酵温度为34 ℃，培养时间为4 d时，能得到高级醇的最低值43.72 mg/L。此条件下，发酵液的酒精度为10.1%。