绿豆皮牡荆素对H2O2损伤HUVEC细胞的预防和治疗作用

罗 磊 杜冠尚 张向辉 夏迎利 段雪莹 朱文学

(河南科技大学食品与生物工程学院；河南省农产品干燥装备工程技术研究中心，洛阳 471023)

心脑血管疾病是一类高患病率和高死亡率的疾病，致死率居世界首位，严重威胁人类尤其是中老年人健康[1, 2]。人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)，是覆盖于心血管和淋巴管内表面的单层扁平细胞，其氧化损伤能诱发多种血管类疾病，相比其他细胞具有繁殖快，培养周期短等特点。曹致超等[3]建立HUVEC细胞氧化损伤模型，考察黄芩茎叶总黄酮对其保护作用及机制；吴琼等[4]探究荭草花提取物对H2O2诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用研究。氧化应激反应是造成血管内皮细胞损伤的重要因素之一，H2O2作为体内常见的活性氧分子，能直接作用于细胞膜，造成脂质过氧化，破坏细胞组织[5, 6]，常被用来诱导细胞氧化建立损伤模型。

绿豆(Mung Bean)，又名青小豆，蝶花亚科豇豆属，产量和出口量均居世界首位[7, 8]。绿豆皮是包裹在绿豆外部的种皮，占绿豆质量的8%，在绿豆深加工过程中常被废弃，造成很大的资源浪费和环境污染[9]。研究表明，绿豆皮中黄酮含量为10.18 mg/g，牡荆素占其中的51.99%，被认为是绿豆皮主要抗氧化成分[10]。An等[11]发现金莲花牡荆素能提高小鼠血清SOD等抗氧化酶系，延缓衰老；Guimaraes等[12]研究发现牡荆素能减弱Aβ神经毒性，减轻细胞损伤；周欣等[13]发现牡荆素能抑制细胞内自由基活性，减少活性氧复合物。目前鲜见牡荆素对HUVEC细胞氧化损伤的预防和治疗作用，因此本实验以绿豆皮牡荆素为研究对象，考察其对HUVEC细胞氧化损伤的保护作用，以期为绿豆皮应用于血管类疾病的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿豆皮牡荆素实验室自制；禾盛泽绿豆皮，粉碎过筛；纤维素酶(酶活≥150 U/mg)辅助APG联合超声醇提，经HPD100B大孔吸附树脂纯化所得；人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)、DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、噻唑蓝(methyl thiazoly1 tetrazolium，MTT)、双抗(青霉素-链霉素)、二甲基亚砜(DMSO)、BCA蛋白定量试剂盒、MDA、SOD、LDH、GSH、GSH-Px测定试剂盒；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SNWTZ-5N冷冻干燥箱，XKX41倒置微镜，FM-CJ-6FD超净工作台，E191IR型CO2细胞培养箱，XW-80A漩涡混合仪，L5S紫外-可见分光光度计，680全自动酶标仪，KQ-500DE超声波清洗仪，HH-S6A水浴锅。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，1.7 μm)；紫外检测器波长278nm；柱温：25 ℃；进样量20 μL；流速1.0 mL/min；流动相：A为水(0.5%甲酸)，B为乙腈(色谱级)；梯度洗脱条件：0～3 min，5% B；3～6 min，10% B；6～9 min，15% B；9～12 min，20% B；12～15 min，25% B；15～20 min，30% B；20～25 min，20% B；25～30 min，10%B；30～35 min，5%B。

1.3.2 绿豆皮牡荆素提取和含量测定

提取方法参照李侠等[10]、HAN等[14]有改动，并利用HPLC法进行含量测定[15]：称取10 g过80目筛的绿豆皮粉末，放入90 mL水中，加入0.5%纤维素酶，在pH4.5、50 ℃条件下酶解60 min，沸水灭酶3 min，抽滤得滤渣和酶提液V1，滤渣和70%乙醇以1∶10的比例混合，加入APG0810调整浓度为0.5%、调pH为8.5，室温浸泡2.5 h后，350 W、50 ℃超声45 min，过滤得提取液V2，合并V1、V2得绿豆皮牡荆素粗提液V，50 ℃旋蒸浓缩至一定体积，4倍体积无水乙醇沉淀离心去大分子，过0.22 μm滤膜，278 nm下高效液相色谱测定峰值，带入牡荆素标准曲线(y=41.997x+16.217，R2=0.999 5)，按式(1)计算提取量：

(1)

式中：C为绿豆皮牡荆素浓度；V为粗提液总体积；N为稀释倍数；M为绿豆皮质量。

1.3.3 绿豆皮牡荆素的纯化

预处理HPD-100B型树脂，将2 BV质量浓度为1.5 mg/mL的绿豆皮牡荆素提取液以1.5 mL/min的速度过柱吸附(pH 4.0)，吸附完全后先用3 BV蒸馏水洗脱除杂，再用3BV体积分数为70%的乙醇以1.0 mL/min的速度进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至有淡黄色固体析出，真空冷冻干燥得绿豆皮牡荆素，测定纯度为(81.690±0.241)%。

1.3.4 HUVEC细胞培养

配制含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，将复苏后细胞移入装有适量培养基的25 cm2的细胞培养瓶中。在5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养观察，及时更换培养液，待细胞覆盖率达80%左右，以1∶2比例传代。

1.3.5 HUVEC细胞氧化损伤模型建立

取对数生长期细胞悬液加入相同比例台盼蓝溶液，进行细胞计数，调整细胞浓度为2.0×105个/mL，每孔200 μL接种于96孔板，在5% CO2、37 ℃条件下培养至细胞贴壁。弃上清，加入不同浓度H2O2进行细胞损伤，共10个梯度，6个平行，相同条件下培养24 h，PBS冲洗1～3次，每孔先加入200 μL培养基、再加入10 μL质量浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h弃上清，每孔加入150 μLDMSO，室温放置10 min，放入酶标仪，调节滤光片至490 nm，记录吸光度值，带入式(2)计算细胞存活率。

(2)

式中：A0为空白组吸光度均值；A1为不同浓度H2O2吸光度均值。

1.3.6 绿豆皮牡荆素质量浓度选择

用培养基配制不同浓度的绿豆皮牡荆素溶液代替H2O2，其余操作步骤及计算方法参照1.3.5。

1.3.7 细胞及细胞培养液制备

预防组：在六孔板中设置空白组、模型组、低、中、高剂量组、VC对照组，参照1.3.5调整细胞浓度为2.0×105个/mL，每孔接种2.0 mL，在5% CO2、37 ℃条件下培养24 h，弃培养液。3个剂量组各加入2.0 mL相应质量浓度的绿豆皮牡荆素培养液；对照组加入2.0 mL质量浓度为100 μg/mL的VC培养液，其余两组加入2.0 mL培养基，5% CO2、37 ℃条件下培养24 h，弃上清。除空白组外每孔加入2.0 mL浓度为900 μmol/L的H2O2，在相同条件细胞培养箱中培养4 h。收集培养液离心(1 500 r/min、5 min)取上清待测；细胞消化后，用PBS吹洗离心(1 000 r/min、10 min)，取细胞沉淀团块加1.0 mLPBS，冰浴超声破碎(450 W、5s/次、间隔30 s、重复3次)待测。

治疗组：按上述步骤将细胞接种培养24 h后，先加入H2O2损伤细胞，再加入不同浓度绿豆皮牡荆素溶液和VC培养液，其余操作方法保持不变。

1.3.8 MDA、SOD、LDH、GSH、GSH-Px测定

参照试剂盒方法测定细胞及培养液中的各项指标。

1.4 数据处理

用Origin85软件作图、用DPS7.5软件中Tukey法进行完全随机单因素方差分析，不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱结果

经HPD100B大孔吸附树脂纯化后绿豆皮牡荆素色谱图如图1b所示，与图1a牡荆素标准溶液色谱峰保留时间一致，说明提取成分为牡荆素。

图1 标准品和样品HPLC色谱图

2.2 过氧化氢及绿豆皮牡荆素浓度筛选

过氧化氢(H2O2)是机体氧化应激过程中产生的活性氧，能分解产生氧自由基，过量存在可诱发细胞内的某些蛋白变性，造成内皮细胞损伤从而导致细胞凋亡[16-18]。如图2，H2O2浓度越高对HUVEC细胞抑制作用越明显，细胞存活率越低。当H2O2浓度为900 μmol/L时，细胞半数致死，存活率为51.32%。H2O2浓度过高细胞死亡损伤严重，浓度过低不能有效抑制细胞生长，两种情况均不能客观反映后期药物处理对细胞的保护作用[19]，因此选择900 μmol/L作为模型损伤浓度。

绿豆皮牡荆素质量浓度在0～100 μg/mL范围内，细胞存活率与浓度呈正相关，药物浓度越高，细胞存活率越高；小于60μg/mL时，药物对细胞生长影响不显著(P>0.05)；为60、80、100 μg/mL时，细胞增值加速，影响效果显著(P<0.05)，存活率分别为110.61%、122.3%、131.68%；药物浓度高于100 μg/mL时，产生高浓度抑制，细胞存活率显著下降(P<0.05)。因此选择能显著促进细胞生产的药物浓度作为后期低、中、高剂量处理浓度(即60、80、100 μg/mL)。

图2 不同浓度H2O2及绿豆皮牡荆素对HUVEC细胞生长的影响

2.3 HUVEC细胞及培养液中MDA含量

MDA是机体中氧自由基与多不饱和脂肪酸结合产物，能降低细胞免疫机能，影响细胞分裂，促使细胞凋亡[20-22]。如图3，H2O2能显著增高细胞和培养液中MDA含量(P<0.05)，不同浓度药物处理均能显著降低MDA含量(P<0.05)；预防组细胞和培养液中MDA含量整体低于治疗组，且药物浓度越大，组间差异越小；治疗组细胞中MDA抑制能力与药物

图3 HUVEC细胞和培养液中MDA含量

浓度呈明显正相关(P<0.05)；当药物浓度为100 μg/mL时，预防组细胞和培养液中MDA含量与VC对照组基本一致。说明一定浓度的绿豆皮牡荆素能降低MDA含量，增强细胞抗氧化能力，且损伤前预防优于损伤后治疗。

2.4 HUVEC细胞及培养液中SOD活性

SOD是机体内重要的酶类抗氧化物，能通过歧化反应及时清理氧自由基，是反映机体抗氧化能力的重要指标[23-25]。从图4可看出，H2O2处理后细胞及培养液中SOD活力显著降低，剂量组与模型组相比SOD活力显著上升(P<0.05)；治疗组细胞和培养液中SOD活力高于预防组；当绿豆皮牡荆素质量浓度为100 μg/mL时，治疗组细胞和培养液中SOD活力与VC组持平(P>0.05)；预防组药物质量浓度为80、100 μg/mL时，培养液中SOD活性相差不大。说明绿豆皮牡荆素质量浓度在80～100 μg/mL内，能起到调节机体内氧化平衡的作用。

图4 HUVEC细胞和培养液中SOD活性

2.5 HUVEC 细胞及培养液中LDH活性

LDH是一种存在于细胞内部，促进机体能量代谢的氧化还原类酶，当细胞受损时，会透过细胞膜渗透到细胞外部，其活性大小可客观反映细胞损伤程度[26, 27]。如图5，H2O2处理能显著降低细胞中LDH活性，提高培养液中LDH活性(P<0.05)；预防组和治疗组细胞中，低、中、高剂量组LDH活性差异显著，与药物浓度呈明显正相关(P<0.05)，浓度为100 μg/mL时，治疗组细胞中LDH活性与VC治疗组无明显差异(P>0.05)；预防组和治疗组培养液中LDH活性随药物浓度变化差异不显著(P>0.05)，中、高剂量药物治疗效果几乎与VC组持平。

图5 HUVEC细胞和培养液中LDH活性

2.6 HUVEC细胞及培养液中GSH含量

GSH是细胞内重要的代谢调节物质，能还原机体细胞在氧化损伤过程中残存的H2O2为H2O，本身作为反应底物被大量消耗，因此GSH含量可作为评价机体抗氧化能力大小的指标[28, 29]。如图6所示，

图6 HUVEC细胞和培养液中GSH含量

H2O2能显著降低细胞和培养液中GSH含量(P<0.05)；治疗组细胞和培液中GSH含量与药物剂量呈显著正相关(P<0.05)，中、高剂量药物(绿豆皮牡荆素质量浓度分别为80、100 μg/mL时)处理后，预防组细胞和培养液中GSH含量差异不显著(P>0.05)；当药物质量浓度100 μg/mL时，治疗组细胞和预防组培养液中GSH含量与VC处理组无显著差异(P>0.05)。

2.7 HUVEC 细胞及培养液中GSH-Px活性

GSH-Px是机体内广泛存在的抗氧化酶，能特异催化GSH与H2O2反应生成H2O，从而降低体内H2O2浓度，维持细胞结构完整性，在机体抗氧化过程中表现积极[30, 31]。如图7，模型损伤组、剂量组细胞和培养液中GSH-Px活性相比空白组显著下降(P<0.05)，各药物处理组细胞和培养液中GSH-Px活性相比模型组显著上升(P<0.05)，各剂量组之间存在明显差异；当药物质量浓度为100 μg/mL时，治疗组细胞和培养液中GSH-Px活力与VC处理组无明显差异(P>0.05)。

图7 HUVEC细胞和培养液中GSH-Px活性

3 讨论

机体内促氧因子和抗氧因子失衡导致的自由基过剩能诱导细胞衰老病变，是造成心脑血管疾病和癌症等慢性疾病产生的重要因素，因此增加机内抗氧化物质是治疗这类疾病的有效手段[32]。研究表明食物中的活性成分(酚类、黄酮等)能显著抑制体内自由基活动，长期食用富含抗氧化成分的食物能增强人体免疫力，减少血管类疾病的发病率[33-35]。

牡荆素的抗氧化活性与其结构密切相关，其C环上连接的酚羟基活性最高，能与自由基反应生成较稳定的半醌式自由基，从而终止自由基的链式反应，其C2和C3之间的双键结构在一定程度上能增强B环酚羟基作用，增强抗氧化效果[36, 37]。关于牡荆素是否能在机体内直接作用于内皮细胞，以及其在体内的代谢产物有待进一步研究。

4 结果

采用H2O2诱导HUVEC细胞建立细胞氧化损伤模型，观察不同绿豆皮牡荆素浓度对细胞生长的影响，确定最佳药物浓度，探究其对细胞氧化损伤的预防和保护作用。结果表明，H2O2能不同程度的抑制HUVEC细胞增值，900 μmol/L H2O2浓度为最佳损伤浓度；HUVEC细胞存活率在一定范围内随绿豆皮牡荆素浓度增加，呈现先上升后下降的趋势；无论是损伤前预防还是损伤后治疗，低、中、高浓度绿豆皮牡荆素均能显著降低细胞和培养液中MDA含量，增加GSH含量，提高SOD、GSH-Px酶活，并存在一定剂量依赖性；同时绿豆皮牡荆素能减轻细胞膜受损程度，阻碍细胞内LDH渗透到细胞外；当药物质量浓度为100 μg/mL时，细胞保护能力相当于VC对氧化损伤细胞的保护能力。绿豆皮牡荆素有较好的抗氧化能力，能有效避免机体有害成分和活性氧累积，提高各种抗氧化酶类活性，保护细胞完整性。